Двухфотонный микроскоп

Двухфотонный микроскоп — это разновидность флуоресцентного микроскопа, в котором для возбуждения флуорофоров используется эффект одновременного поглощения двух фотонов с длиной волны, вдвое большей, чем длина волны однофотонного возбуждения. Основным преимуществом метода является возможность визуализации живых биологических тканей на глубине до 1 мм и более, что значительно превосходит возможности конфокальной микроскопии. Технология основана на нелинейном оптическом эффекте, открытом в 1931 году Марией Гёпперт-Майер, и получила практическое воплощение в 1990-х годах.

История

Теоретические основы

В 1931 году немецкий физик Мария Гёпперт-Майер (впоследствии лауреат Нобелевской премии) теоретически предсказала возможность двухфотонного поглощения. Она показала, что атом или молекула может одновременно поглотить два фотона, если их суммарная энергия соответствует энергии перехода между энергетическими уровнями. Вероятность такого процесса крайне мала и пропорциональна квадрату интенсивности падающего света, поэтому для его наблюдения требуются источники света с очень высокой пиковой мощностью.

Первые реализации

Практическое применение эффекта стало возможным только после создания лазеров с ультракороткими импульсами. В 1961 году Вольфганг Кайзер и Чарльз Гарретт из Bell Labs впервые экспериментально наблюдали двухфотонное возбуждение в кристалле фторида кальция, легированного европием. Однако для биологических применений потребовалось ещё три десятилетия.

В 1990 году группа учёных под руководством Уинфрида Денка (Winfried Denk) и Уотта Уэбба (Watt W. Webb) из Корнеллского университета впервые продемонстрировала работу двухфотонного микроскопа для визуализации живых биологических образцов. Они использовали лазер с синхронизацией мод, генерирующий импульсы длительностью около 100 фемтосекунд, для возбуждения флуоресценции в клетках и тканях. Результаты были опубликованы в журнале Science в 1990 году.

Развитие и коммерциализация

В 1990-е и 2000-е годы технология быстро совершенствовалась. Были разработаны специализированные фемтосекундные лазеры, адаптированные для микроскопии, а также новые флуоресцентные красители и генетически кодируемые флуоресцентные белки, оптимизированные для двухфотонного возбуждения. К началу 2000-х годов появились первые коммерческие двухфотонные микроскопы, производимые компаниями, такими как Zeiss, Leica, Olympus и Nikon. В настоящее время двухфотонная микроскопия является стандартным инструментом в нейробиологии, эмбриологии и других областях биомедицины.

Принцип работы

Физическая основа

В основе двухфотонной микроскопии лежит нелинейный процесс двухфотонного поглощения. В отличие от однофотонной флуоресценции, где один фотон с энергией, достаточной для возбуждения флуорофора, поглощается молекулой, при двухфотонном возбуждении два фотона с вдвое меньшей энергией (и, соответственно, вдвое большей длиной волны) поглощаются одновременно. Для этого необходимо, чтобы оба фотона оказались в одной точке пространства в один и тот же момент времени (с точностью до времени жизни виртуального состояния, порядка 10⁻¹⁵ секунды).

Вероятность двухфотонного поглощения пропорциональна квадрату интенсивности света. Это означает, что она существенна только в фокальной области, где интенсивность максимальна. Вне фокуса интенсивность быстро падает, и вероятность двухфотонного возбуждения становится пренебрежимо малой. Таким образом, возбуждение флуорофоров происходит только в очень малом объёме — эллипсоиде размером порядка 0,5–1 мкм в поперечнике и 1–3 мкм по оси z.

Оптическая схема

Типичный двухфотонный микроскоп включает следующие основные компоненты:

• Источник возбуждения: фемтосекундный лазер (обычно титан-сапфировый или Yb-волоконный), генерирующий импульсы длительностью 50–200 фс с частотой повторения 80–100 МГц. Длина волны перестраивается в диапазоне 680–1080 нм для титан-сапфировых лазеров.
• Система сканирования: гальвано-зеркала или резонансные сканеры для быстрого перемещения лазерного луча по образцу в плоскости XY.
• Объектив: высокоапертурный микроскопный объектив (числовая апертура 0,8–1,4), фокусирующий лазерный луч в пятно субмикронного размера.
• Детектор: обычно фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или лавинный фотодиод, установленный вне оптического пути возбуждения. Флуоресцентный сигнал собирается тем же объективом и отделяется от возбуждающего света дихроичным зеркалом и фильтрами.
• Система управления и сбора данных: компьютер с программным обеспечением для управления сканированием и регистрации сигнала, формирующего изображение.

Сравнение с конфокальной микроскопией

Ключевое отличие двухфотонной микроскопии от конфокальной заключается в способе уменьшения фонового сигнала. В конфокальном микроскопе используется точечная диафрагма (пинхол), которая отсекает свет, приходящий из внефокальных плоскостей. В двухфотонном микроскопе фоновый сигнал отсутствует в принципе, поскольку флуоресценция возникает только в фокусе. Это даёт несколько преимуществ:

• Глубокое проникновение: из-за использования более длинноволнового света (ближний инфракрасный диапазон) рассеяние в биологических тканях значительно меньше, чем для видимого света. Это позволяет визуализировать структуры на глубине до 1 мм и более.
• Меньшее фотоповреждение: возбуждение происходит только в фокальном объёме, а не во всём образце, как в конфокальной микроскопии. Это снижает фототоксичность и фотообесцвечивание, что критически важно для наблюдения за живыми клетками и тканями в течение длительного времени.
• Отсутствие необходимости в пинхоле: упрощается оптическая схема и увеличивается эффективность сбора света, особенно при работе с толстыми образцами, где рассеянный свет может быть собран детектором.

Применение

Нейробиология

Двухфотонная микроскопия является незаменимым инструментом в нейробиологии. Она позволяет визуализировать отдельные нейроны, дендриты, шипики и синапсы в коре головного мозга живых животных. С её помощью изучают:

• Динамику синаптической пластичности (например, долговременную потенциацию и депрессию).
• Изменения структуры нейронов при обучении и памяти.
• Распространение кальциевых сигналов в нейронных сетях.
• Патологические процессы при нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона).

Эмбриология и развитие

Метод позволяет наблюдать за развитием эмбрионов на клеточном уровне в реальном времени. Исследуются процессы клеточной миграции, дифференцировки, морфогенеза тканей и органов. Благодаря низкой фототоксичности возможна длительная визуализация (часы и сутки) без существенного влияния на развитие организма.

Иммунология

Двухфотонная микроскопия используется для изучения взаимодействия иммунных клеток (Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, дендритных клеток) в лимфатических узлах и других тканях. Визуализируются процессы миграции, антигенпрезентации, образования иммунных синапсов и формирования иммунного ответа.

Онкология

Метод применяется для исследования микроокружения опухолей, ангиогенеза, метастазирования и взаимодействия раковых клеток с иммунной системой. Визуализация в реальном времени позволяет оценить эффективность противоопухолевых препаратов и методов терапии.

Другие области

• Ботаника: изучение структуры и физиологии растений на клеточном уровне.
• Дерматология: неинвазивная диагностика кожных заболеваний, включая меланому.
• Микроскопия in vivo: наблюдение за процессами в различных органах (печень, почки, поджелудочная железа) через хронические имплантированные окошки.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Глубокое проникновение: до 1 мм и более в биологических тканях.
• Низкая фототоксичность: возбуждение только в фокусе, что позволяет проводить длительные наблюдения за живыми объектами.
• Высокое пространственное разрешение: субмикронное разрешение в трёх измерениях.
• Возможность спектральной мультиплексации: использование нескольких флуорофоров с разными спектрами возбуждения и эмиссии.
• Совместимость с другими методами: например, с флуоресцентной корреляционной спектроскопией (FCS) и FRET.

Недостатки

• Высокая стоимость: фемтосекундные лазеры и специализированное оборудование являются дорогостоящими.
• Сложность настройки: требуется высокая квалификация оператора и точная юстировка оптической системы.
• Ограниченная глубина проникновения: при сильном рассеянии света (например, в костной ткани или пигментированных образцах) глубина может быть меньше.
• Фотообесцвечивание: хотя оно локализовано, при длительном сканировании одной области может происходить выгорание флуорофора.
• Тепловые повреждения: при использовании высокой мощности лазера возможно локальное нагревание ткани.

Интересные факты

• Двухфотонный микроскоп был впервые продемонстрирован в 1990 году, а его создатели Уинфрид Денк и Уотт Уэбб получили за эту работу премию Ранка (Rank Prize) в 2002 году.
• В 2014 году Нобелевская премия по химии была присуждена Эрику Бетцигу, Уильяму Мёрнеру и Штефану Хеллю за развитие сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии, которая часто сочетается с двухфотонным возбуждением.
• Существуют модификации двухфотонной микроскопии, такие как трёхфотонная микроскопия, позволяющая достигать ещё большей глубины визуализации (до 1,5–2 мм) за счёт использования ещё более длинноволнового возбуждения.

Источники

• Denk, W., Strickler, J. H., & Webb, W. W. (1990). Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science, 248(4951), 73–76.
• Zipfel, W. R., Williams, R. M., & Webb, W. W. (2003). Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology, 21(11), 1369–1377.
• Helmchen, F., & Denk, W. (2005). Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods, 2(12), 932–940.
• Diaspro, A. (Ed.). (2002). Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications, and Advances. Wiley-Liss.
• Материалы лекций и учебных пособий по флуоресцентной микроскопии (МГУ, Институт биофизики РАН).