Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — это метод лазерной клеточной сортировки и подсчёта, позволяющий одновременно измерять физические и химические характеристики клеток или других биологических частиц, взвешенных в потоке жидкости. Метод основан на прохождении каждой клетки через луч света и регистрации параметров рассеяния и флуоресценции. Проточная цитометрия широко применяется в медицине, биологии, иммунологии и генетике для диагностики заболеваний, анализа клеточного цикла, оценки иммунного статуса и выделения чистых популяций клеток.

История

Развитие проточной цитометрии началось в середине XX века. В 1953 году американский изобретатель Уоллес Коултер запатентовал принцип подсчёта и измерения частиц в электропроводящей жидкости (принцип Коултера), который лёг в основу первых гематологических анализаторов. В 1965 году Л. А. Каменский и М. Р. Меламед в США предложили использовать лазер для возбуждения флуоресценции в клетках. В 1969 году был создан первый проточный цитометр с возможностью сортировки клеток (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), разработанный группой Леонарда Херценберга в Стэнфордском университете. В 1970-х годах метод начал внедряться в клиническую практику, а в 1980-х — в иммунологию для идентификации субпопуляций лимфоцитов. В 1990-х годах появление многопараметрических анализаторов (до 4–6 флуоресцентных каналов) позволило одновременно изучать десятки маркеров на одной клетке. В 2000-х годах развитие масс-цитометрии (CyTOF) и спектральной цитометрии расширило возможности метода до 40–50 параметров. В России первые проточные цитометры появились в 1970-х годах в научно-исследовательских институтах (например, в Институте молекулярной биологии РАН), а с 1990-х годов метод активно используется в клинической лабораторной диагностике.

Принцип работы

Проточная цитометрия основана на гидродинамической фокусировке, оптическом детектировании и электронной обработке сигналов.

Гидродинамическая фокусировка

Суспензия клеток подаётся в центр потока оболочной жидкости (sheath fluid), которая движется с большей скоростью. За счёт ламинарного течения клетки выстраиваются в одну линию и проходят через лазерный луч поодиночке. Это обеспечивает точное измерение каждой частицы.

Оптическая система

Лазер (обычно аргоновый, 488 нм, или диодный, 405 нм, 532 нм, 633 нм) освещает клетку. При прохождении луча регистрируются два основных типа рассеяния:

• Прямое рассеяние (Forward Scatter, FSC) — свет, рассеянный под малым углом (1–10°), пропорционален размеру клетки.
• Боковое рассеяние (Side Scatter, SSC) — свет, рассеянный под углом 90°, отражает внутреннюю сложность (гранулярность, структуру ядра, количество органелл).

Дополнительно регистрируется флуоресценция, возникающая после возбуждения флуорохромов, связанных с клеточными маркерами (например, антитела, меченные FITC, PE, APC). Каждый флуорохром имеет свой спектр эмиссии, который разделяется дихроичными зеркалами и фильтрами на отдельные детекторы (фотодиоды или фотоэлектронные умножители).

Электронная обработка

Сигналы с детекторов преобразуются в цифровые значения и анализируются программным обеспечением. Для каждой клетки вычисляются параметры (FSC, SSC, интенсивность флуоресценции по каждому каналу). Результаты представляются в виде гистограмм, точечных диаграмм (scatter plots) или двумерных плотностных графиков.

Классификация

Проточные цитометры делятся на аналитические и сортирующие.

Аналитические цитометры

Предназначены только для измерения параметров клеток. Они не могут выделять клетки из потока. Примеры: BD FACSCanto, Beckman Coulter Navios, CytoFLEX (Beckman Coulter). В клинической практике используются для иммунофенотипирования, подсчёта CD4+ лимфоцитов, анализа ДНК.

Сортирующие цитометры (FACS)

Оснащены механизмом сортировки: после анализа клеточная капля заряжается электрически и отклоняется в заданную ёмкость с помощью электродов. Это позволяет выделять чистые популяции клеток (до 99% чистоты) для дальнейшего культивирования, секвенирования или функциональных тестов. Примеры: BD FACSAria, Sony SH800, MoFlo Astrios (Beckman Coulter). Сортировка может быть стерильной и проводиться в условиях ламинарного шкафа.

Применение

Проточная цитометрия используется в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также в клинической лабораторной диагностике.

Медицина

• Иммунофенотипирование — определение субпопуляций лимфоцитов (CD4+ T-хелперы, CD8+ цитотоксические T-клетки, B-клетки, NK-клетки) для диагностики ВИЧ-инфекции, первичных иммунодефицитов, аутоиммунных заболеваний.
• Гематология — диагностика лейкозов и лимфом (острый миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз) по экспрессии кластеров дифференцировки (CD-маркеров).
• Онкология — анализ клеточного цикла (определение доли клеток в фазах G0/G1, S, G2/M), выявление анеуплоидии, оценка апоптоза (по Annexin V, пропидию йодиду).
• Трансплантология — мониторинг химеризма после трансплантации костного мозга, определение уровня донорских клеток.
• Микробиология — идентификация бактерий и грибов по размеру и гранулярности, оценка жизнеспособности (Live/Dead staining).

Биология

• Клеточная биология — изучение пролиферации (CFSE-мечение), дифференцировки, апоптоза, клеточного цикла, фагоцитоза.
• Иммунология — анализ активации T-клеток (по CD69, CD25), цитокиновой продукции (внутриклеточное окрашивание), цитотоксичности.
• Генетика — флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) на клетках, определение плоидности, анализ микроядер.
• Стволовые клетки — выделение и характеризация гемопоэтических стволовых клеток (CD34+), мезенхимальных стволовых клеток.

Промышленность и экология

• Биотехнология — контроль качества клеточных культур (гибридомы, CHO-клетки), оценка продуктивности рекомбинантных белков.
• Водная микробиология — подсчёт бактерий и фитопланктона в природных водах, оценка токсичности.
• Пищевая промышленность — обнаружение патогенных микроорганизмов (например, Salmonella, Listeria) в продуктах.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая скорость анализа (до 100 000 клеток в секунду).
• Многопараметричность (одновременное измерение до 30–50 параметров на клетку).
• Количественная оценка (концентрация, процентное содержание, абсолютное число клеток).
• Возможность сортировки живых клеток с сохранением их функциональности.
• Автоматизация и стандартизация (результаты воспроизводимы).

Ограничения

• Необходимость суспензии одиночных клеток (ткани требуют ферментативной или механической диссоциации).
• Высокая стоимость оборудования и расходных материалов (антитела, флуорохромы, sheath fluid).
• Сложность интерпретации многопараметрических данных (требует специального программного обеспечения и навыков).
• Ограниченная чувствительность для редких событий (менее 0,01% популяции требует предварительного обогащения).
• Артефакты из-за агрегации клеток, неспецифического связывания антител, фотообесцвечивания флуорохромов.

Современные направления

Спектральная проточная цитометрия

Использует детекторы, регистрирующие полный спектр флуоресценции (от 400 до 800 нм) для каждой клетки. Это позволяет различать флуорохромы с перекрывающимися спектрами и увеличивать число одновременно измеряемых параметров до 40–50. Примеры: Cytek Aurora, Sony ID7000.

Масс-цитометрия (CyTOF)

Вместо флуоресцентных меток используются антитела, конъюгированные с изотопами металлов (например, лантаноиды). Клетки ионизируются плазмой, и масс-спектрометр определяет содержание каждого изотопа. Позволяет измерять до 40–50 параметров без спектрального перекрытия. Недостаток — разрушение клеток (невозможна сортировка).

Микрофлюидная цитометрия

Миниатюризация проточных цитометров на чипе (lab-on-a-chip). Использует микрофлюидные каналы и интегрированные детекторы. Обеспечивает портативность, низкую стоимость и малый объём образца (1–10 мкл). Применяется в полевой диагностике и для анализа единичных клеток.

Высокопроизводительная цитометрия (HTS)

Автоматизированные системы, способные анализировать 96-, 384- или 1536-луночные планшеты. Используются в скрининге лекарственных препаратов, токсикологии, геномике.

Интересные факты

• Первый коммерческий проточный цитометр (FACS I) был выпущен компанией Becton Dickinson (BD) в 1973 году.
• В 1980-х годах метод проточной цитометрии использовался для анализа клеток крови у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС для оценки мутаций.
• Максимальное количество параметров, измеряемых в одном эксперименте, превышает 50 (например, на спектральных цитометрах Cytek Aurora).
• В России проточная цитометрия входит в стандарт диагностики ВИЧ-инфекции (подсчёт CD4+ лимфоцитов) и острых лейкозов (иммунофенотипирование).

Источники

• Shapiro H. M. Practical Flow Cytometry. — 4th ed. — Wiley, 2003.
• Givan A. L. Flow Cytometry: First Principles. — 2nd ed. — Wiley, 2001.
• Ormerod M. G. Flow Cytometry: A Practical Approach. — 3rd ed. — Oxford University Press, 2000.
• BD Biosciences. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. — 2015.
• Приказ Минздрава России от 13.03.2019 № 124н «Об утверждении стандарта медицинской помощи при ВИЧ-инфекции».
• Лекции по проточной цитометрии (кафедра клинической лабораторной диагностики РНИМУ им. Н. И. Пирогова).