Секвенирование ДНК: методы и применение¶

Секвенирование ДНК — это совокупность методов определения первичной нуклеотидной последовательности молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Результатом секвенирования является формальное описание порядка чередования четырёх азотистых оснований (аденина, гуанина, цитозина и тимина), которое составляет генетическую информацию организма. Технология лежит в основе современной молекулярной биологии, генетики и медицины.

¶История развития

Первые методы секвенирования появились в 1970-х годах. В 1977 году Фредерик Сенгер разработал метод обрыва цепи (дидезоксинуклеотидный метод), который позволял читать последовательности длиной до нескольких сотен пар оснований. В том же году Уолтер Гилберт и Аллан Максам предложили химический метод деградации. Метод Сенгера, благодаря своей надёжности, стал доминирующим и использовался при реализации проекта «Геном человека», завершённого в 2003 году.

Переломным моментом стало появление в середине 2000-х годов технологий секвенирования нового поколения (NGS, next-generation sequencing), которые позволили секвенировать миллионы фрагментов ДНК параллельно. Это многократно снизило стоимость и время анализа, сделав возможным полногеномное секвенирование в рутинной практике.

¶Методы секвенирования

¶Секвенирование по Сенгеру

Классический метод основан на синтезе комплементарной цепи ДНК с включением модифицированных нуклеотидов (дидезоксинуклеотидов), которые терминально обрывают синтез. Фрагменты разной длины разделяются с помощью капиллярного электрофореза. Метод обеспечивает высокую точность (до 99,999 %) и используется для секвенирования коротких фрагментов (до 1000 пар оснований), например, при подтверждении точечных мутаций.

¶Секвенирование нового поколения (NGS)

Технологии NGS включают несколько платформ, наиболее распространёнными из которых являются:

• Пиросеквенирование (Roche 454) — детекция высвобождаемого пирофосфата при включении нуклеотида.
• Секвенирование путём синтеза (Illumina) — флуоресцентно меченые нуклеотиды с обратимыми терминаторами, детекция по свечению на проточной кчейке. Эта технология занимает доминирующее положение на рынке.
• Ионоторрентное секвенирование (Thermo Fisher) — регистрация изменения pH при включении нуклеотида.
• Секвенирование нанопорами (Oxford Nanopore) — пропускание одноцепочечной ДНК через белок-пору и измерение изменения ионного тока. Позволяет читать сверхдлинные фрагменты (до 2 млн пар оснований) в реальном времени.

¶Секвенирование третьего поколения

К этому классу относят технологии, позволяющие секвенировать единичные молекулы ДНК без этапа амплификации, что устраняет ошибки ПЦР. Сюда относятся нанопоровое секвенирование и технология SMRT (Pacific Biosciences), основанная на наблюдении за синтезом ДНК в реальном времени.

¶Применение

Секвенирование ДНК используется в широком спектре областей:

• Медицинская генетика: диагностика наследственных заболеваний, выявление носительства мутаций, фармакогенетика (подбор дозировок лекарств).
• Онкология: секвенирование опухолевого генома для выявления драйверных мутаций и выбора таргетной терапии, мониторинг минимальной остаточной болезни.
• Инфекционная диагностика: идентификация возбудителей, определение устойчивости к антибиотикам, эпидемиологическое типирование штаммов.
• Судебная медицина: идентификация личности по образцам ДНК, установление родства.
• Сельское хозяйство: селекция сортов растений и пород животных, геномная паспортизация.
• Биоинформатика: аннотация геномов, сравнительная геномика, метагеномный анализ микробных сообществ.
• Археогенетика: изучение древней ДНК для реконструкции миграций и эволюции человека.

¶Ограничения и перспективы

Основным ограничением методов NGS является необходимость фрагментации ДНК и последующей сборки коротких прочтений (100–300 пар оснований), что затрудняет анализ повторяющихся регионов генома. Нанопоровые технологии решают эту проблему, но имеют более высокий уровень ошибок. Дальнейшее развитие направлено на повышение точности, удешевление и возможность секвенирования в полевых условиях.

¶Источники

• Сенгер Ф. Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК // Биохимия, 1981.
• Metzker M. L. Sequencing technologies — the next generation // Nature Reviews Genetics, 2010.
• Goodwin S., McPherson J. D., McCombie W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies // Nature Reviews Genetics, 2016.
• Лекции курса «Геномика» МГУ имени М. В. Ломоносова.