Секвенирование нового поколения

Секвенирование нового поколения (NGS, от англ. Next Generation Sequencing) — это совокупность методов высокопроизводительного определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК, позволяющих одновременно анализировать миллионы фрагментов генетического материала за один цикл анализа. В отличие от классического метода Сэнгера, который секвенирует один фрагмент за раз, NGS обеспечивает параллельную обработку огромного количества молекул, что делает возможным полногеномное секвенирование за часы или дни.

История

Развитие технологий секвенирования прошло несколько этапов. Первое поколение, основанное на методе Сэнгера (1977 год), было трудоёмким и дорогим: для расшифровки генома человека потребовалось около 13 лет и 3 миллиарда долларов. В середине 2000-х годов появились технологии второго поколения, которые кардинально изменили ситуацию.

Появление платформ второго поколения

В 2005 году компания 454 Life Sciences (США) представила первый коммерческий NGS-секвенатор, основанный на пиросеквенировании. В 2006 году компания Solexa (Великобритания) выпустила систему Genome Analyzer, использующую технологию секвенирования путём синтеза с обратимыми терминаторами. В 2007 году компания Illumina приобрела Solexa, и её платформы стали доминирующими на рынке. Параллельно развивалась технология SOLiD (Applied Biosystems, США, 2007 год), основанная на лигировании.

Технологии третьего поколения

С 2010-х годов начали внедряться методы секвенирования отдельных молекул в реальном времени (SMRT, Pacific Biosciences, США) и нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания). Эти технологии позволяют читать очень длинные фрагменты ДНК (десятки тысяч пар оснований) без предварительной амплификации, что упрощает сборку геномов и выявление структурных перестроек.

Принципы работы

Несмотря на разнообразие платформ, все NGS-методы включают общие этапы:

Подготовка библиотеки: ДНК или РНК фрагментируется на короткие куски (обычно 100–600 пар оснований). К ним присоединяют адаптеры — короткие синтетические последовательности-«штрихкоды», которые позволяют идентифицировать образец и прикреплять его к поверхности для секвенирования.
Амплификация: Каждый фрагмент многократно копируется (например, методом мостиковой ПЦР на проточной ячейке Illumina или эмульсионной ПЦР на шариках у 454) для создания кластера идентичных молекул. Это необходимо для усиления сигнала.
Секвенирование: Считывание нуклеотидной последовательности происходит путём добавления нуклеотидов или лигирования олигонуклеотидов. Каждый цикл регистрирует сигнал (флуоресценцию, изменение pH или электрического тока).
Биоинформатический анализ: Полученные «сырые» данные (прочтения, или риды) выравниваются на референсный геном или собираются de novo в контиги. Затем проводятся поиск вариантов (SNP, инделы, CNV), аннотация генов и другие анализы.

Классификация методов

По технологии детекции

Секвенирование путём синтеза (SBS): ДНК-полимераза встраивает флуоресцентно меченные нуклеотиды, и после каждого цикла считывается сигнал. Основные платформы — Illumina (MiSeq, HiSeq, NovaSeq) и MGI (DNBSEQ).
Пиросеквенирование: Регистрируется выделение пирофосфата при встраивании нуклеотида. Использовалось в платформе 454, ныне практически вытеснено.
Секвенирование путём лигирования: Фрагменты ДНК сшиваются с мечеными олигонуклеотидами (SOLiD).
Нанопоровое секвенирование: Одиночная молекула ДНК проходит через белковую пору (нанопору), и измеряются изменения ионного тока, зависящие от нуклеотидного состава (Oxford Nanopore).
Секвенирование одной молекулы в реальном времени (SMRT): ДНК-полимераза фиксируется на дне наноячейки, и флуоресцентные сигналы от встраиваемых нуклеотидов регистрируются в реальном времени (PacBio).

По длине прочтений

Короткие прочтения (Short-read): 50–300 пар оснований. Высокая точность (99,9% и выше), низкая стоимость за гигабазу. Используются для ресеквенирования, RNA-seq, метагеномики. Платформы — Illumina, MGI.
Длинные прочтения (Long-read): от 10 000 до сотен тысяч пар оснований. Позволяют собирать сложные повторяющиеся участки генома, выявлять структурные варианты, секвенировать полноразмерные транскрипты. Точность ниже (85–95%), но постоянно улучшается. Платформы — PacBio, Oxford Nanopore.

Применение

NGS произвел революцию во многих областях биологии и медицины.

Медицина

Клиническая генетика: Поиск мутаций, вызывающих наследственные заболевания (секвенирование экзома или генома). Позволяет диагностировать редкие болезни, которые ранее оставались невыявленными.
Онкология: Секвенирование опухолевой ткани (соматические мутации, профиль экспрессии генов). Применяется для выбора таргетной терапии, мониторинга минимальной остаточной болезни и выявления резистентности.
Пренатальная диагностика: Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) — анализ фрагментов ДНК плода в крови матери для выявления хромосомных аномалий (синдром Дауна, Эдвардса, Патау).
Фармакогеномика: Определение генетических вариантов, влияющих на метаболизм лекарств (например, CYP2C19, VKORC1), для подбора индивидуальной дозировки.

Биология и экология

Геномика: Сборка полных геномов новых организмов, сравнительная геномика, эволюционные исследования.
Транскриптомика (RNA-seq): Измерение уровня экспрессии генов, выявление альтернативного сплайсинга, некодирующих РНК.
Метагеномика: Секвенирование ДНК из образцов окружающей среды (почва, вода, кишечная микробиота) для идентификации видов и функционального потенциала сообществ микроорганизмов.
Эпигенетика: Изучение метилирования ДНК (Bisulfite-seq) и модификаций гистонов (ChIP-seq).

Сельское хозяйство и криминалистика

Селекция растений и животных: Маркер-ассоциированная селекция, геномная оценка племенной ценности.
Криминалистика: Анализ сложных смесей ДНК, идентификация личности по фрагментарным образцам.

Преимущества и ограничения

Преимущества

Высокая пропускная способность: Один запуск может дать до нескольких терабаз данных.
Параллелизм: Возможность анализировать сотни образцов одновременно (мультиплексирование).
Низкая стоимость за нуклеотид: Стоимость секвенирования человеческого генома снизилась с 3 млрд долларов в 2003 году до примерно 600–1000 долларов в 2024 году.
Широкий спектр приложений: От поиска мутаций до анализа экспрессии и метилирования.

Ограничения

Ошибки секвенирования: Наиболее частые — вставки/делеции (в длинных прочтениях) и замена оснований (в коротких прочтениях). Требуется валидация важных находок другими методами.
Проблемы с повторами: Короткие прочтения не могут однозначно выровняться на повторяющиеся участки генома (центромеры, теломеры, сателлиты).
Сложность биоинформатического анализа: Требуются мощные вычислительные ресурсы и квалифицированные специалисты.
Высокая стоимость оборудования: Приобретение и обслуживание секвенаторов остаются дорогими.

Современное состояние и перспективы

Рынок NGS-технологий активно развивается. Компания Illumina сохраняет лидерство в сегменте коротких прочтений, однако китайская MGI (BGI) наращивает долю. В сегменте длинных прочтений конкурируют Pacific Biosciences (системы Revio, Onso) и Oxford Nanopore (системы PromethION, MinION). Последняя особенно примечательна тем, что её приборы портативны (размером с флешку) и позволяют проводить секвенирование в полевых условиях, включая космос (на МКС).

Основные направления развития включают:

Увеличение точности длинных прочтений до уровня коротких.
Снижение стоимости до 100 долларов за геном.
Интеграция с искусственным интеллектом для автоматического анализа и интерпретации данных.
Развитие одноклеточного секвенирования (scRNA-seq, scDNA-seq) для изучения гетерогенности тканей.

Источники

Goodwin, S., McPherson, J. D., & McCombie, W. R. (2016). Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics, 17(6), 333–351.
Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies — the next generation. Nature Reviews Genetics, 11(1), 31–46.
Van Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., & Thermes, C. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics, 30(9), 418–426.
Illumina, Inc. (2024). An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology. Technical Note.
Oxford Nanopore Technologies. (2023). The Technology: How Nanopore Sequencing Works.

BFOmetr — база данных и аналитика по компаниям России.

На главную BFOmetr →