T-ДНК

T-ДНК (от англ. transfer DNA, «переносимая ДНК») — это участок ДНК, содержащийся в Ti-плазмиде (tumor-inducing, «опухоль-индуцирующая») почвенных бактерий рода Agrobacterium (например, Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes). При заражении растения бактерия переносит T-ДНК в ядерный геном растительной клетки, где она интегрируется и вызывает образование опухолей (корончатых галлов) или разрастание корней. T-ДНК является ключевым инструментом в генной инженерии растений, поскольку позволяет встраивать чужеродные гены в геном растений.

История открытия

Явление переноса ДНК от бактерии к растению было обнаружено в 1970-х годах. В 1974 году американские учёные Дж. Темин и И. Верма показали, что Agrobacterium tumefaciens способна передавать часть своей плазмидной ДНК в растительные клетки. В 1977 году группа исследователей под руководством М. Д. Чилтона впервые идентифицировала T-ДНК как участок Ti-плазмиды, который обнаруживается в ядерной ДНК опухолевых клеток растений. В 1983 году, после разработки методов удаления онкогенов из T-ДНК, эта система была впервые использована для создания трансгенных растений (табак, устойчивый к антибиотику канамицину). С тех пор T-ДНК стала основой большинства методов генетической трансформации двудольных растений.

Структура T-ДНК

T-ДНК представляет собой фрагмент Ti-плазмиды длиной от 20 до 30 тысяч пар оснований (т.п.н.). Её структура включает три основных компонента:

1. Граничные последовательности (border sequences) — две короткие (около 25 п.н.) прямые повторы, расположенные на левом (LB, left border) и правом (RB, right border) концах T-ДНК. Они являются сайтами узнавания для ферментов, осуществляющих вырезание и перенос T-ДНК. Правый граничный повтор критически важен для начала переноса; левый — для завершения.

1. Онкогены — гены, вызывающие трансформацию растительных клеток:

• iaaM и iaaH — кодируют ферменты синтеза ауксина (индол-3-уксусной кислоты);
• ipt — кодирует изопентенилтрансферазу, участвующую в синтезе цитокининов;
• 6b — ген, усиливающий чувствительность клеток к гормонам.

Совместное действие этих генов приводит к неконтролируемому делению клеток и образованию опухоли.

1. Гены опинового синтеза — кодируют ферменты, синтезирующие опины (производные аминокислот, например, нопалин, октопин). Опины служат источником углерода и азота для бактерии, но не усваиваются растением-хозяином.

В генной инженерии онкогены и гены опинового синтеза удаляют из T-ДНК, заменяя их целевыми генами и селективными маркерами (например, геном устойчивости к антибиотику).

Механизм переноса T-ДНК

Перенос T-ДНК из бактерии в растительную клетку — многостадийный процесс, опосредованный белками системы Vir (от англ. virulence). Основные этапы:

1. Распознавание сигналов растения. Бактерия Agrobacterium чувствует фенольные соединения (например, ацетосирингон), выделяемые повреждёнными растительными клетками. Это активирует экспрессию генов vir на Ti-плазмиде.

1. Вырезание T-ДНК. Белки VirD1 и VirD2 (эндонуклеазы) разрезают T-ДНК по правому и левому граничным повторам. VirD2 ковалентно связывается с 5'-концом разрезанной цепи, образуя комплекс T-цепь — VirD2.

1. Образование T-комплекса. T-цепь (одноцепочечная ДНК) покрывается белком VirE2, который защищает её от нуклеаз и придаёт компактную форму. Образуется так называемый T-комплекс.

1. Транспорт в растительную клетку. T-комплекс вместе с белками VirD2, VirE2 и другими (например, VirB — компонентами секреционной системы IV типа) переносится через бактериальную мембрану и клеточную стенку, а затем через плазматическую мембрану растения.

1. Ядерный импорт и интеграция. В цитоплазме растительной клетки T-комплекс распознаётся белками импортином и транспортируется в ядро. Интеграция T-ДНК в геном растения происходит случайным образом, преимущественно в транскрипционно активные участки, с помощью механизмов репарации ДНК хозяина (негомологичное соединение концов).

Применение в генной инженерии

T-ДНК является основным вектором для создания трансгенных растений, особенно двудольных (например, табак, томат, картофель, соя). Процесс включает:

1. Конструирование бинарного вектора. Целевой ген вставляют между граничными повторами T-ДНК в плазмиде, которая может реплицироваться как в E. coli, так и в Agrobacterium. Онкогены удаляют, чтобы избежать образования опухолей.

1. Трансформация Agrobacterium. Бинарный вектор переносят в штамм Agrobacterium, содержащий Ti-плазмиду с генами vir (но без T-ДНК).

1. Кокультивирование. Бактерии инкубируют с эксплантами растения (кусочками листа, стебля или каллусом) в присутствии фенольных индукторов.

1. Селекция трансформантов. Растительные клетки, интегрировавшие T-ДНК, отбирают по селективному маркеру (например, устойчивость к антибиотику или гербициду).

1. Регенерация растений. Из трансформированных клеток выращивают целые растения в условиях in vitro.

Метод T-ДНК позволяет вводить в растения гены устойчивости к вредителям (например, Bt-токсин), гербицидам (глифосат), улучшать питательные свойства (золотой рис с повышенным содержанием бета-каротина) или получать фармацевтические белки (молекулярное фермерство).

Ограничения и альтернативы

T-ДНК-опосредованная трансформация наиболее эффективна для двудольных растений. Для однодольных (злаки, рис, пшеница) природная система Agrobacterium работает хуже из-за низкой чувствительности к фенольным индукторам и барьеров клеточной стенки. Для таких культур разработаны альтернативные методы: биобаллистика (генная пушка) и использование модифицированных штаммов Agrobacterium с оптимизированными генами vir.

Кроме того, интеграция T-ДНК в геном растения происходит случайным образом, что может приводить к нежелательным мутациям (инсерционному мутагенезу). Для точного встраивания генов в определённые локусы разрабатываются системы редактирования генома (CRISPR/Cas9), которые могут сочетаться с T-ДНК для доставки компонентов.

Интересные факты

• Природная T-ДНК содержит гены, которые заставляют растительную клетку синтезировать опины — вещества, которые бактерия использует как пищу. Это пример эволюционной адаптации, где бактерия «программирует» растение на производство своей пищи.
• Agrobacterium tumefaciens способна заражать не только растения, но и, в лабораторных условиях, дрожжи, грибы и даже клетки человека, хотя интеграция T-ДНК в геном животных происходит крайне редко.
• T-ДНК — единственный известный в природе случай межцарственного переноса ДНК от прокариот к эукариотам, который стал основой для биотехнологии.

Источники

• Chilton, M. D. et al. (1977). "Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis". Cell.
• Gelvin, S. B. (2003). "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the 'gene-jockeying' tool". Microbiology and Molecular Biology Reviews.
• Tzfira, T. & Citovsky, V. (2006). "Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology". Current Opinion in Biotechnology.
• Zupan, J. et al. (2000). "The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights". The Plant Journal.