Негомологичное соединение концов¶

Негомологичное соединение концов (англ. non-homologous end joining, NHEJ) — это один из основных путей репарации двуцепочечных разрывов ДНК в клетках эукариот, при котором концы разорванной молекулы ДНК лигируются (сшиваются) напрямую, без использования гомологичной матрицы. В отличие от гомологичной рекомбинации, NHEJ не требует наличия неповреждённой гомологичной последовательности ДНК и может приводить к потере или вставке нескольких нуклеотидов в месте соединения, что делает этот механизм высокоэффективным, но потенциально мутагенным. NHEJ является доминирующим путём репарации двуцепочечных разрывов в клетках млекопитающих, особенно в G1-фазе клеточного цикла, и играет ключевую роль в поддержании геномной стабильности, а также в процессах V(D)J-рекомбинации в иммунной системе.

¶Механизм

Процесс NHEJ включает несколько последовательных этапов, которые обеспечивают распознавание разрыва, защиту концов, процессинг (если необходимо) и лигирование. Основные белки, участвующие в этом пути, консервативны от дрожжей до человека.

¶Распознавание и связывание концов

Ключевым событием является связывание гетеродимера Ku70/Ku80 (в клетках млекопитающих) с концами двуцепочечного разрыва. Белок Ku имеет кольцевую структуру, которая нанизывается на ДНК, защищая концы от деградации и предотвращая нежелательные реакции. После связывания Ku привлекает каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), образуя активный комплекс DNA-PK. Этот комплекс фосфорилирует множество белков-мишеней, включая себя, что способствует сборке репарационного комплекса.

¶Процессинг концов

Поскольку концы разрыва часто несовместимы для прямого лигирования (например, содержат выступающие одноцепочечные участки, повреждённые основания или химические модификации), требуется их обработка. Этот этап осуществляется с помощью набора ферментов, включая:

• Нуклеазы: например, комплекс Artemis:DNA-PKcs, который обладает эндонуклеазной активностью и способен удалять неспаренные участки и шпильки.
• Полимеразы: ДНК-полимеразы семейства X (Pol μ и Pol λ) могут добавлять нуклеотиды, часто в шаблон-независимой манере, заполняя бреши.
• Фосфатазы и киназы: например, полинуклеотидкиназа (PNKP) восстанавливает 5'-фосфатные и 3'-гидроксильные группы, необходимые для лигирования.

Объём и характер процессинга варьируют в зависимости от структуры концов, что определяет возможные потери или вставки нуклеотидов.

¶Лигирование

Финальный этап катализируется комплексом ДНК-лигазы IV с её кофактором XRCC4. Дополнительный белок XLF (также известный как Cernunnos) стабилизирует комплекс и способствует его связыванию с ДНК. Лигаза IV сшивает сахаро-фосфатный остов, восстанавливая целостность молекулы ДНК. После завершения лигирования комплекс диссоциирует, и ДНК становится доступной для других клеточных процессов.

¶Отличия от гомологичной рекомбинации

NHEJ и гомологичная рекомбинация (HR) являются двумя основными путями репарации двуцепочечных разрывов, но они существенно различаются по механизму и условиям применения.

Выбор между NHEJ и HR регулируется клеточным циклом, стадией развития и доступностью гомологичной матрицы. В клетках млекопитающих NHEJ доминирует, особенно в нереплицирующихся клетках.

¶Роль в V(D)J-рекомбинации

NHEJ является критическим компонентом V(D)J-рекомбинации — процесса, который генерирует разнообразие антител и Т-клеточных рецепторов в адаптивной иммунной системе позвоночных. В ходе этого процесса RAG-нуклеазы (RAG1 и RAG2) вносят двуцепочечные разрывы на границах V, D и J сегментов генов иммуноглобулинов. Затем NHEJ сшивает эти разрывы, причём процессинг концов (добавление нуклеотидов с помощью TdT, терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) вносит дополнительную вариабельность, создавая так называемые N-вставки. Дефекты в белках NHEJ (например, мутации в Artemis, XRCC4 или Lig4) приводят к тяжёлым комбинированным иммунодефицитам (SCID) у человека и мышей.

¶Клиническое значение

Нарушения в работе NHEJ связаны с рядом заболеваний человека, включая иммунодефициты, повышенную чувствительность к ионизирующему излучению и предрасположенность к раку.

¶Иммунодефициты

Мутации в генах, кодирующих белки NHEJ, являются причиной некоторых форм тяжёлого комбинированного иммунодефицита (SCID). Например, мутации в гене Artemis (DCLRE1C) вызывают SCID с радиочувствительностью (RS-SCID), при котором пациенты страдают от отсутствия Т- и В-клеток и крайне чувствительны к радиации. Мутации в гене LIG4 (ДНК-лигаза IV) также приводят к SCID, часто сопровождающемуся микроцефалией и задержкой развития.

¶Радиочувствительность

Клетки с дефектами NHEJ (например, в линиях с нокаутом Ku70/80 или DNA-PKcs) демонстрируют резко повышенную чувствительность к ионизирующему излучению и радиомиметическим препаратам, поскольку они неспособны эффективно репарировать индуцированные облучением двуцепочечные разрывы. Это свойство используется в радиобиологии для изучения механизмов репарации.

¶Онкология

Хотя NHEJ в норме поддерживает стабильность генома, его ошибки (вставки, делеции, транслокации) могут способствовать канцерогенезу. Например, хромосомные транслокации, характерные для многих лейкозов и лимфом, часто возникают в результате ошибочного NHEJ при репарации разрывов, возникающих в ходе V(D)J-рекомбинации или под действием генотоксических агентов. С другой стороны, ингибирование NHEJ рассматривается как потенциальная стратегия для повышения эффективности радиотерапии и химиотерапии, поскольку оно делает опухолевые клетки более чувствительными к повреждениям ДНК.

¶Эволюционная консервативность

NHEJ обнаружен у всех доменов жизни, включая бактерии и археи, хотя у прокариот он менее распространён и часто представлен более простыми системами (например, система LigD у бактерий). У эукариот NHEJ является древним и высококонсервативным механизмом, что подчёркивает его фундаментальную роль в выживании клеток. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae NHEJ также активен, но его вклад в репарацию разрывов меньше, чем у млекопитающих, из-за большей доступности гомологичной рекомбинации.

¶Интересные факты

• Белок Ku был впервые идентифицирован у пациентов с системной красной волчанкой как аутоантиген, что дало ему название (от японского «Ku» — «девятый», по номеру пациента).
• NHEJ может репарировать разрывы с сильно повреждёнными или несовместимыми концами, что делает его «универсальным» механизмом, работающим в условиях, когда гомологичная рекомбинация невозможна.
• В некоторых вирусах, например, аденовирусах, NHEJ используется для интеграции вирусной ДНК в геном хозяина, что способствует персистенции инфекции.

¶Источники

• Lieber, M. R. (2010). The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry, 79, 181–211.
• Pannunzio, N. R., Watanabe, G., & Lieber, M. R. (2018). Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. Journal of Biological Chemistry, 293(27), 10512–10523.
• Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., & Lieber, M. R. (2017). Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 18(8), 495–506.
• Ochi, T., Blackford, A. N., Coates, J., et al. (2015). DNA repair. PAXX, a paralog of XRCC4 and XLF, interacts with Ku to promote DNA double-strand break repair. Science, 347(6218), 185–188.
• Malu, S., Malshetty, V., Francis, D., & Cortes, P. (2012). Role of non-homologous end joining in V(D)J recombination. Immunologic Research, 54(1-3), 233–246.