Технология CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 — это технология редактирования геномов высших организмов, основанная на адаптивной иммунной системе бактерий и архей. Она позволяет вносить направленные изменения в последовательности ДНК, включая удаление, вставку или замену определённых генетических фрагментов. Система состоит из двух ключевых компонентов: направляющей РНК (sgRNA), которая обеспечивает специфичность, и нуклеазы Cas9, которая разрезает обе цепи ДНК в заданном участке. Технология получила широкое распространение в молекулярной биологии, медицине, сельском хозяйстве и биотехнологии благодаря своей эффективности, относительной простоте и универсальности.

История открытия и развития

Предпосылки и ранние исследования

Открытие CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) началось в 1987 году, когда японский учёный Ёсидзуми Исино впервые описал необычные повторяющиеся последовательности в геноме кишечной палочки Escherichia coli. В течение последующих лет аналогичные структуры были обнаружены у многих бактерий и архей. В 2005 году несколько исследовательских групп независимо друг от друга показали, что спейсеры между повторами соответствуют фрагментам ДНК вирусов (бактериофагов), что указывало на роль системы в защите от вирусной инфекции.

Функциональная характеристика

В 2007 году группа под руководством Родольфа Баррангу и Филиппа Хорвата из компании Danisco (Дания) экспериментально доказала, что CRISPR-система обеспечивает приобретённый иммунитет у бактерий. Они показали, что после заражения фагом бактерии встраивают фрагменты его ДНК в свой CRISPR-локус, и при повторной атаке эти последовательности используются для распознавания и уничтожения вирусной ДНК. В 2008 году исследователи из компании Danisco и Университета Копенгагена продемонстрировали, что для разрезания ДНК необходимы белки Cas (CRISPR-associated), в частности Cas9. В 2010 году французская группа под руководством Сильвена Муано показала, что Cas9 является эндонуклеазой, разрезающей ДНК в строго определённом месте, комплементарном направляющей РНК.

Адаптация для редактирования геномов эукариот

Ключевой прорыв произошёл в 2012 году, когда группа Эммануэль Шарпантье (Институт Макса Планка, Германия) и Дженнифер Дудны (Калифорнийский университет в Беркли, США) опубликовали статью, в которой показали, что систему CRISPR/Cas9 можно перепрограммировать для разрезания произвольных последовательностей ДНК in vitro. Они предложили использовать одну направляющую РНК (sgRNA) вместо двух природных РНК, что значительно упростило систему. В 2013 году несколько групп, включая команду Фэна Чжана (Институт Броуда, США), независимо продемонстрировали, что CRISPR/Cas9 работает в клетках млекопитающих, включая человеческие. За открытие и развитие технологии CRISPR/Cas9 Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году.

Механизм действия

Компоненты системы

Система CRISPR/Cas9 включает два основных компонента:

• Нуклеаза Cas9 — фермент, который разрезает ДНК. Наиболее часто используется Cas9 из бактерии Streptococcus pyogenes (SpCas9). Белок содержит два каталитических домена: HNH (разрезает цепь, комплементарную направляющей РНК) и RuvC (разрезает противоположную цепь).
• Направляющая РНК (sgRNA) — синтетическая молекула РНК, состоящая из двух частей: CRISPR РНК (crRNA), комплементарной целевой последовательности ДНК, и транс-активирующей РНК (tracrRNA), которая связывается с Cas9. sgRNA определяет место разрезания.

Этапы редактирования

1. Связывание: sgRNA связывается с Cas9, образуя рибонуклеопротеиновый комплекс. Комплекс сканирует ДНК в поисках последовательности, комплементарной sgRNA.
2. Распознавание: Для связывания необходимо наличие короткого мотива PAM (protospacer adjacent motif) — последовательности длиной 2–5 нуклеотидов, расположенной сразу после целевого сайта. Для SpCas9 PAM-последовательность — 5'-NGG-3'. Если PAM присутствует и sgRNA комплементарна ДНК, происходит связывание.
3. Разрезание: Cas9 вносит двуцепочечный разрыв (DSB) в ДНК на расстоянии 3 нуклеотидов от PAM.
4. Ремонт: Клетка восстанавливает разрыв с помощью одного из двух механизмов:

• Негомологичное соединение концов (NHEJ): основной путь репарации, часто приводящий к вставкам или делециям (инделам), что может нарушить рамку считывания гена и вызвать его нокаут.
• Гомологичная репарация (HDR): происходит при наличии матрицы для репарации (например, донорной ДНК). Позволяет вставить или заменить определённую последовательность.

Применение

Фундаментальные исследования

CRISPR/Cas9 широко используется для изучения функций генов. С помощью нокаута или нокина (вставки) определённых генов в клеточных линиях или модельных организмах (мыши, дрозофилы, дрожжи, растения) исследователи выясняют их роль в развитии, метаболизме, канцерогенезе и других процессах. Система также применяется для создания репортёрных конструкций, мечения белков флуоресцентными метками и изучения регуляторных элементов генома.

Медицина

Технология рассматривается как перспективный инструмент для генной терапии наследственных заболеваний. В клинических испытаниях изучается возможность коррекции мутаций, вызывающих серповидноклеточную анемию, бета-талассемию, муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна и некоторые формы слепоты. В 2023 году в Великобритании и США была одобрена первая терапия на основе CRISPR/Cas9 — Casgevy (exagamglogene autotemcel) для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии, разработанная компаниями Vertex Pharmaceuticals и CRISPR Therapeutics. В онкологии CRISPR/Cas9 используется для создания CAR-T-клеток с улучшенными свойствами и для нокаута генов, связанных с устойчивостью к иммунотерапии.

Сельское хозяйство

В растениеводстве CRISPR/Cas9 применяется для улучшения сельскохозяйственных культур: повышения урожайности, устойчивости к болезням и вредителям, улучшения питательных свойств. Например, созданы сорта риса с повышенной устойчивостью к бактериальному ожогу, грибной болезни; помидоры с увеличенным содержанием ликопина; грибы, не темнеющие при хранении. В животноводстве технология используется для создания линий свиней, устойчивых к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома, и для увеличения мышечной массы у крупного рогатого скота.

Биотехнология и промышленность

CRISPR/Cas9 применяется для модификации микроорганизмов (дрожжей, бактерий) с целью повышения выхода ценных метаболитов (антибиотиков, ферментов, биотоплива). Система также используется для создания синтетических генетических цепей и для маркировки клеток в исследовательских целях.

Варианты и модификации

Улучшенные нуклеазы

Для повышения специфичности и снижения частоты нецелевого разрезания (офф-таргет эффектов) были разработаны модифицированные версии Cas9:

• eSpCas9 — содержит мутации, снижающие неспецифическое связывание с ДНК.
• SpCas9-HF1 — имеет четыре аминокислотные замены, уменьшающие взаимодействие с нецелевыми последовательностями.
• HypaCas9 — гиперточная версия, сохраняющая высокую активность на целевых сайтах.

Каталитически неактивные варианты

• dCas9 (dead Cas9) — нуклеаза с мутациями в обоих каталитических доменах, не разрезающая ДНК, но сохраняющая способность связываться с целевыми последовательностями. Используется для:
• CRISPRi (интерференция) — подавление транскрипции гена путём блокирования РНК-полимеразы.
• CRISPRa (активация) — активация транскрипции путём присоединения активаторных доменов к dCas9.
• Визуализация — мечение определённых участков генома флуоресцентными белками.

Другие нуклеазы

• Cas12a (Cpf1) — нуклеаза, разрезающая ДНК с образованием липких концов и не требующая tracrRNA. Используется для мультиплексного редактирования.
• Cas13 — нуклеаза, нацеленная на РНК, а не на ДНК. Применяется для редактирования транскриптов и диагностики вирусных инфекций.

Этические и правовые аспекты

Редактирование зародышевой линии

Наибольшие этические споры вызывает применение CRISPR/Cas9 для редактирования генома человеческих эмбрионов и половых клеток (зародышевой линии). Изменения, внесённые на этом уровне, наследуются потомством, что вызывает опасения по поводу непредсказуемых долгосрочных последствий и возможного использования технологии для «улучшения» человека (евгеники). В 2018 году китайский учёный Хэ Цзянькуй объявил о рождении первых детей с отредактированным геномом (ген CCR5, предположительно для устойчивости к ВИЧ), что вызвало международное осуждение и привело к ужесточению регулирования. В большинстве стран, включая Россию, редактирование зародышевой линии человека законодательно запрещено.

Регулирование и патентные споры

Патентные права на CRISPR/Cas9 стали предметом длительных судебных разбирательств между Калифорнийским университетом (группа Дудны) и Институтом Броуда (группа Чжана). В 2017 году суд США признал приоритет Института Броуда на использование технологии в эукариотических клетках, в то время как Калифорнийский университет получил патенты на использование в прокариотах. В Европе и других юрисдикциях решения различаются. В России регулирование геномного редактирования осуществляется в рамках Федерального закона «О биологической безопасности» и других нормативных актов, которые требуют лицензирования и этической экспертизы для клинических исследований.

Офф-таргет эффекты и безопасность

Несмотря на значительное повышение точности, CRISPR/Cas9 всё ещё может вызывать нецелевые разрезания, что потенциально может привести к нежелательным мутациям. Разработка методов обнаружения и минимизации офф-таргет эффектов остаётся активной областью исследований. Для клинического применения требуется тщательная проверка безопасности и эффективности.

Интересные факты

• Название CRISPR происходит от аббревиатуры, описывающей структуру повторяющихся последовательностей в бактериальных геномах. Термин был введён в 2002 году.
• CRISPR-системы встречаются примерно у 40% секвенированных бактерий и 90% архей.
• В 2015 году китайские учёные впервые применили CRISPR/Cas9 для редактирования генома человеческого эмбриона, но использовали нежизнеспособные эмбрионы.
• Технология используется для создания «генетических часов» — систем, позволяющих отслеживать клеточные процессы в реальном времени.
• В 2020 году CRISPR/Cas9 была применена для диагностики COVID-19 (метод SHERLOCK), позволяя выявлять вирусную РНК с высокой чувствительностью.

Источники

• Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816–821.
• Cong L., Ran F.A., Cox D., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819–823.
• Mali P., Yang L., Esvelt K.M., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121): 823–826.
• Doudna J.A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014, 346(6213): 1258096.
• Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278.
• Ledford H. CRISPR: the disruptor. Nature, 2015, 522(7554): 20–24.
• Решение Европейского суда по делу C-528/16 (2018) о статусе организмов, полученных с помощью CRISPR.