Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum — это грамположительная, неподвижная, неспорообразующая бактерия, относящаяся к роду коринебактерий (Corynebacterium). В природе она встречается в почве и на поверхности растений. Основное значение микроорганизма заключается в его способности к промышленному производству аминокислот, в первую очередь L-глутаминовой кислоты и L-лизина, что сделало его одним из ключевых объектов биотехнологии и микробиологической промышленности.

История открытия и изучения

В 1957 году японские исследователи Шукуо Киносита (Shukuo Kinoshita) и его коллеги из компании Kyowa Hakko Kogyo Co. (Япония) выделили из почвы штамм бактерии, способный накапливать в культуральной среде значительные количества L-глутаминовой кислоты. Первоначально микроорганизм был классифицирован как Micrococcus glutamicus, но впоследствии, после пересмотра таксономии, был переименован в Corynebacterium glutamicum. Это открытие положило начало промышленному производству аминокислот методом микробиологического синтеза, который вытеснил более дорогой и менее эффективный химический синтез.

В 1960-х годах были разработаны первые промышленные штаммы-продуценты L-лизина, а в 1970-х — L-треонина. С развитием методов генной инженерии в 1980–1990-х годах началась целенаправленная модификация метаболизма C. glutamicum для повышения выхода целевых продуктов. Полная геномная последовательность бактерии (штамм ATCC 13032) была опубликована в 2003 году, что открыло возможности для системной метаболической инженерии.

Таксономия и морфология

Corynebacterium glutamicum относится к классу Actinobacteria, порядку Mycobacteriales, семейству Mycobacteriaceae. Это факультативно анаэробный хемоорганотроф. Клетки имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек длиной 1–3 мкм и диаметром 0,5–0,8 мкм. В стационарной фазе роста клетки могут укорачиваться и принимать кокковидную форму. Бактерия неподвижна, не образует спор и капсул. Клеточная стенка содержит миколовые кислоты (короткоцепочечные, в отличие от микобактерий), арабино-галактановый комплекс и пептидогликан, что придаёт ей высокую механическую прочность и устойчивость к некоторым антибиотикам.

Метаболизм и физиология

C. glutamicum является аэробом, но способен расти в микроаэрофильных условиях. Оптимальная температура роста — 30–37 °C, pH — 7,0–8,0. Бактерия утилизирует широкий спектр углеродных субстратов: глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, ацетат, лактат, а также некоторые органические кислоты. Азот усваивается в виде аммонийных солей, мочевины или нитратов.

Основной путь метаболизма глюкозы — гликолиз (путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса) и пентозофосфатный путь. В цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса) образуются предшественники аминокислот: α-кетоглутарат (предшественник глутаминовой кислоты), оксалоацетат (предшественник аспарагиновой кислоты), пируват (предшественник аланина и валина). Ключевой особенностью C. glutamicum является его способность к сверхсинтезу аминокислот при определённых условиях, например, при лимитировании биотина или добавлении детергентов (например, Tween 60), что нарушает целостность клеточной мембраны и усиливает выделение глутаминовой кислоты.

Генетика и геном

Геном C. glutamicum (штамм ATCC 13032) представляет собой кольцевую хромосому длиной около 3,3 млн пар оснований, содержащую примерно 3000 генов. Геном характеризуется высоким содержанием GC-пар (около 54%). В геноме присутствуют несколько профагов и мобильных генетических элементов. Для генетической модификации бактерии разработаны эффективные системы трансформации, включая электропорацию и конъюгацию. Широко используются векторы на основе плазмид pBL1, pCG1 и pGA1. Методы генной инженерии позволяют проводить делеции, вставки и замены генов, а также регулировать экспрессию целевых генов с помощью индуцибельных промоторов.

Промышленное применение

Производство аминокислот

Основное применение C. glutamicum — промышленный синтез аминокислот. Ежегодно в мире производится более 2 миллионов тонн L-глутаминовой кислоты (в виде глутамата натрия — усилителя вкуса E621) и более 1 миллиона тонн L-лизина (кормовая добавка). Кроме того, C. glutamicum используется для получения:

• L-треонина,
• L-триптофана,
• L-валина,
• L-аргинина,
• L-изолейцина.

Процесс ферментации проводится в асептических условиях в биореакторах объёмом до 500 м³. В качестве субстрата чаще всего используют гидролизаты крахмала (кукурузный, маниоковый), мелассу, а также уксусную кислоту. После ферментации аминокислоты выделяют из культуральной жидкости методами ионообменной хроматографии, кристаллизации или мембранной фильтрации.

Производство других продуктов

В последние годы C. glutamicum рассматривается как платформа для производства:

• Органических кислот (янтарная, молочная, пировиноградная).
• Полимеров (полигидроксиалканоаты, полиамиды).
• Биотоплива (этанол, изобутанол).
• Витаминов (пантотеновая кислота, рибофлавин).
• Белков и ферментов (например, рекомбинантный инсулин, факторы роста).

Метаболическая инженерия и штаммы

Для повышения продуктивности и расширения спектра целевых продуктов применяются методы метаболической инженерии:

• Усиление путей биосинтеза целевых аминокислот (например, увеличение копийности генов lysC и dapA для лизина).
• Блокирование или ослабление конкурирующих путей (например, делеция генов aceA и aceB для предотвращения расщепления изоцитрата в глиоксилатный цикл).
• Оптимизация транспорта (увеличение экспорта аминокислот из клетки с помощью белков-транспортёров, таких как LysE и GltS).
• Создание ауксотрофных мутантов (например, по гомосериндегидрогеназе для сверхсинтеза лизина).

Современные штаммы-продуценты достигают продуктивности по L-лизину до 120 г/л и по L-глутаминовой кислоте до 150 г/л.

Безопасность и экология

C. glutamicum считается безопасным микроорганизмом (GRAS — Generally Recognized as Safe) для промышленного использования. Он не является патогенным для человека, животных и растений. При работе с ним не требуется специальных мер биобезопасности, кроме стандартных для работы с микроорганизмами II класса опасности. В производственных условиях отходы ферментации (биомасса, остаточные субстраты) утилизируются или перерабатываются в кормовые добавки. В России и других странах использование C. glutamicum в промышленности регулируется санитарными нормами и правилами для микробиологических производств.

Интересные факты

• Открытие C. glutamicum в 1957 году привело к революции в пищевой промышленности: до этого глутамат натрия получали исключительно из гидролизатов пшеничного белка или морских водорослей, что было дорого и неэффективно.
• В 2000-х годах был создан штамм C. glutamicum, способный синтезировать L-лизин из глицерина — побочного продукта производства биодизеля, что позволяет снизить себестоимость и сделать процесс более экологичным.
• Бактерия используется в качестве модельного организма для изучения регуляции метаболизма коринебактерий и актинобактерий в целом.

Источники

• Kinoshita, S., Udaka, S., & Shimono, M. (1957). Studies on the amino acid fermentation. Part I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms. Journal of General and Applied Microbiology, 3(3), 193–205.
• Ikeda, M., & Nakagawa, S. (2003). The Corynebacterium glutamicum genome: features and impacts on biotechnological processes. Applied Microbiology and Biotechnology, 62(2–3), 99–109.
• Eggeling, L., & Bott, M. (Eds.). (2005). Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC Press.
• Becker, J., & Wittmann, C. (2012). Bio-based production of chemicals, materials and fuels – Corynebacterium glutamicum as a versatile cell factory. Current Opinion in Biotechnology, 23(4), 631–640.
• Wendisch, V. F. (2014). Microbial production of amino acids and derived chemicals: Corynebacterium glutamicum as a cell factory. Biotechnology Advances, 32(5), 897–907.