FISH-гибридизация¶

FISH-гибридизация (от англ. fluorescence in situ hybridization, флуоресцентная гибридизация in situ) — это цитогенетический метод, позволяющий выявлять и определять положение специфических последовательностей ДНК или РНК на хромосомах, в ядрах клеток или на тканевых срезах с использованием флуоресцентно меченых зондов. Метод основан на способности одноцепочечных нуклеиновых кислот (зондов) образовывать комплементарные связи с целевыми последовательностями в фиксированном биологическом материале, после чего сигнал визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии.

¶История

Метод FISH был разработан в конце 1970-х — начале 1980-х годов как развитие более ранней техники гибридизации in situ с использованием радиоактивных изотопов. В 1969 году Джозеф Гэлл и Мэри-Лу Пардью впервые применили гибридизацию с радиоактивными зондами для локализации рибосомной РНК на хромосомах шпорцевой лягушки. Однако радиоактивные методы были трудоёмкими, требовали длительной экспозиции и не обеспечивали высокого разрешения.

В 1982 году группа Дэвида Уорда (Йельский университет) впервые описала использование флуоресцентных меток для гибридизации in situ, что позволило значительно повысить скорость и безопасность анализа. В 1986 году была разработана техника многоцветной FISH, позволяющая одновременно детектировать несколько генетических мишеней. С 1990-х годов метод стал широко внедряться в клиническую диагностику, особенно в онкологию и пренатальную генетику.

¶Принцип метода

FISH-гибридизация основана на трёх ключевых этапах:

Денатурация — разделение двух цепей ДНК в образце (или в зонде) на одноцепочечные молекулы путём нагревания или химической обработки.
Гибридизация — инкубация образца с флуоресцентно меченым зондом, который комплементарно связывается с целевой последовательностью.
Отмывка и детекция — удаление несвязавшихся зондов и визуализация сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа.

В отличие от ПЦР, FISH не требует амплификации ДНК и позволяет анализировать генетический материал непосредственно в контексте клеточной или тканевой архитектуры.

¶Типы зондов

В зависимости от задачи используются различные типы зондов:

Локус-специфичные зонды — комплементарны уникальным последовательностям (например, определённым генам или участкам хромосом). Используются для выявления делеций, амплификаций или транслокаций.
Центромерные зонды — нацелены на повторяющиеся последовательности центромерных регионов. Применяются для подсчёта числа хромосом (анэуплоидий).
Цельнохромосомные зонды (или «хромосомные краски») — наборы зондов, покрывающие всю длину конкретной хромосомы. Позволяют выявлять хромосомные перестройки, такие как транслокации.
Теломерные зонды — специфичны к теломерным участкам хромосом. Используются для изучения стабильности хромосом и процессов старения.

¶Основные модификации метода

¶Многоцветная FISH (M-FISH, SKY)

Позволяет одновременно окрашивать каждую хромосому уникальной комбинацией флуорофоров. Применяется для комплексного анализа кариотипа, особенно при сложных хромосомных перестройках.

¶FISH на интерфазных ядрах (I-FISH)

Анализ проводится на не делящихся клетках, что позволяет изучать генетические аномалии в покоящихся клетках (например, в опухолевых тканях).

¶РНК-FISH

Используется для детекции и локализации молекул РНК (мРНК, некодирующих РНК) в клетках. Метод широко применяется в исследованиях экспрессии генов и вирусной инфекции.

¶Комбинированная FISH (CISH, SISH)

Вместо флуоресцентных меток используются хромогенные или серебряные метки, что позволяет визуализировать сигнал при обычной световой микроскопии. Часто применяется в патологоанатомической практике.

¶Применение

¶Клиническая генетика

Пренатальная диагностика: выявление хромосомных аномалий (синдром Дауна, Эдвардса, Патау) в клетках амниотической жидкости или ворсин хориона.
Постнатальная диагностика: подтверждение делеций (например, синдром ДиДжорджи), дупликаций и транслокаций у пациентов с врождёнными пороками развития.
Генетика рака: выявление специфических транслокаций (например, BCR-ABL при хроническом миелоидном лейкозе), амплификаций онкогенов (HER2/neu при раке молочной железы) и делеций генов-супрессоров (например, 1p/19q при глиомах).

¶Онкология

FISH является стандартным методом для определения статуса гена HER2 в биоптатах рака молочной железы и желудка, а также для выявления перестроек генов ALK, ROS1 и RET при раке лёгкого. В гематологии метод используется для диагностики и мониторинга лейкозов и лимфом.

¶Микробиология и вирусология

Детекция патогенов: идентификация бактерий и грибов в тканях (например, Helicobacter pylori в биоптатах желудка).
Вирусная нагрузка: выявление вирусной ДНК/РНК (например, вируса Эпштейна — Барр, цитомегаловируса) в клетках.
Исследование микробиома: анализ состава и пространственного распределения микроорганизмов в образцах.

¶Эволюционная и сравнительная геномика

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) на основе FISH позволяет оценивать различия в числе копий ДНК между видами, что используется для изучения эволюции хромосом.

¶Преимущества и ограничения

¶Преимущества

Высокая специфичность и чувствительность.
Возможность анализа на уровне отдельных клеток.
Сохранение морфологической структуры ткани.
Одновременная детекция нескольких мишеней (до 5–7 флуорофоров в стандартном варианте).
Быстрота выполнения (от нескольких часов до суток).

¶Ограничения

Требуется дорогостоящее оборудование (флуоресцентный микроскоп, наборы фильтров).
Необходимость фиксации и обработки образцов, что может влиять на качество гибридизации.
Ограниченное разрешение — не позволяет различать точечные мутации или небольшие инделы (менее 1–5 тысяч пар оснований).
Флуоресцентные метки со временем выцветают, что затрудняет длительное хранение препаратов.

¶Современные тенденции

В последние годы FISH-гибридизация активно вытесняется методами секвенирования нового поколения (NGS) и цифровой ПЦР для многих диагностических задач. Однако FISH остаётся незаменимым для визуализации пространственного расположения генетических элементов в клетке и ткани, а также в ситуациях, когда требуется быстрый анализ единичных клеток (например, при минимальной остаточной болезни в онкологии). Развиваются методы автоматизированной FISH с использованием роботизированных систем и анализа изображений на основе искусственного интеллекта.

¶Источники

Speicher M.R., Carter N.P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature Reviews Genetics, 2005.
Levsky J.M., Singer R.H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. Journal of Cell Science, 2003.
Bishop R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons, 2010.
Trask B.J. Fluorescence in situ hybridization: applications in cytogenetics and gene mapping. Trends in Genetics, 1991.
Клинические рекомендации по применению FISH-диагностики в онкологии (Минздрав РФ, 2021).