Иммунохроматографический анализ

Иммунохроматографический анализ (ИХА, экспресс-тест, стрип-тест) — это метод качественного или полуколичественного определения антигенов или антител в биологических образцах, основанный на реакции иммунного связывания и последующей визуализации результата за счёт перемещения реагентов по мембране под действием капиллярных сил. ИХА относится к гетерогенным иммунохимическим методам анализа, не требует сложного лабораторного оборудования и позволяет получить результат за 5–15 минут.

История

Разработка иммунохроматографического анализа началась в 1970-х годах, когда были предложены первые концепции сухих химических тестов. В 1980-х годах появились коммерческие тест-полоски для определения беременности по уровню хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в моче. В 1990-х годах метод получил широкое распространение в клинической диагностике, ветеринарии, пищевой промышленности и экологии. В 2000-х годах были разработаны мультиплексные тесты, позволяющие одновременно определять несколько аналитов, а также количественные варианты ИХА с использованием считывающих устройств.

Принцип метода

Иммунохроматографический анализ основан на сочетании иммунохимической реакции и хроматографического разделения. Основные этапы:

1. Нанесение образца. Жидкий образец (кровь, сыворотка, моча, слюна, экстракт) наносится на стартовую зону тест-полоски.
2. Капиллярное перемещение. Образец движется вдоль мембраны за счёт капиллярных сил, проходя через зону, содержащую конъюгат — антитела или антигены, меченные коллоидным золотом, латексными частицами или флуоресцентными красителями.
3. Иммунное связывание. Если в образце присутствует целевой аналит, он связывается с мечеными антителами, образуя комплекс.
4. Фиксация на тестовой линии. Комплекс движется дальше и связывается с иммобилизованными на тестовой линии антителами (или антигенами), что приводит к накоплению метки и появлению окрашенной полосы.
5. Контрольная линия. Избыток меченых реагентов связывается на контрольной линии, подтверждая работоспособность теста.

Устройство тест-полоски

Типичная тест-полоска для ИХА состоит из нескольких слоёв, нанесённых на пластиковую подложку:

• Стартовая подушечка (sample pad) — зона нанесения образца, часто содержит буферные компоненты для стабилизации pH.
• Подушечка с конъюгатом (conjugate pad) — содержит сухие меченые антитела или антигены.
• Нитроклеточная мембрана (membrane) — основная хроматографическая среда, на которой нанесены тестовая и контрольная линии.
• Абсорбирующая подушечка (absorbent pad) — обеспечивает продолжение капиллярного тока и сбор избытка жидкости.

Виды иммунохроматографического анализа

По типу определяемого вещества

• Сэндвич-формат — для определения крупных антигенов (например, вирусных белков, бактерий). Образец содержит антиген, который связывается с мечеными антителами и затем с иммобилизованными антителами на тестовой линии.
• Конкурентный формат — для определения низкомолекулярных соединений (гормонов, лекарств, токсинов). В этом случае меченый антиген конкурирует с антигеном из образца за связывание с антителами на тестовой линии.
• Формат для определения антител — используется для серодиагностики (например, на ВИЧ, гепатит). В тестовой линии иммобилизуют антигены, а в конъюгате — антитела к иммуноглобулинам человека.

По способу детекции

• Визуальный — результат оценивается глазом по появлению окрашенных полос. Обычно используется коллоидное золото, дающее красный или розовый цвет.
• Инструментальный — с помощью портативных считывателей (ридеров), измеряющих интенсивность окраски или флуоресценцию. Позволяет получить количественный результат.

По количеству аналитов

• Одноцелевые — определяют один аналит (например, тест на беременность).
• Мультиплексные — содержат несколько тестовых линий для одновременного определения нескольких веществ (например, тесты на наркотики).

Применение

Медицина

ИХА широко используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, в том числе:

• ВИЧ-инфекция (тесты на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2);
• вирусные гепатиты (HBsAg, анти-HCV);
• коронавирусная инфекция COVID-19 (антигены SARS-CoV-2);
• грипп (A и B);
• стрептококковая инфекция (Streptococcus pyogenes);
• сифилис;
• малярия.

Также применяется для определения:

• беременности (ХГЧ);
• инфаркта миокарда (тропонин, миоглобин);
• наркотических веществ (морфин, кокаин, амфетамины, каннабиноиды);
• уровня глюкозы (в некоторых портативных тестах).

Ветеринария

ИХА используется для диагностики инфекционных заболеваний животных (например, чума плотоядных, парвовирусный энтерит, лейкоз кошек, бешенство), а также для определения половой охоты и беременности.

Пищевая промышленность

Экспресс-тесты применяются для выявления:

• аллергенов (глютен, арахис, соя, молоко);
• патогенных микроорганизмов (сальмонелла, листерия, кишечная палочка);
• микотоксинов (афлатоксины, охратоксины);
• остатков антибиотиков и пестицидов.

Экология

ИХА используется для мониторинга загрязнения воды и почвы (определение пестицидов, тяжёлых металлов, токсинов цианобактерий).

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Быстрота получения результата (5–15 минут);
• простота выполнения (не требует специальной подготовки персонала);
• портативность (тест-полоски компактны, не требуют лабораторного оборудования);
• стабильность реагентов (сухие тесты хранятся при комнатной температуре до 2 лет);
• низкая стоимость;
• возможность использования в полевых условиях.

Недостатки

• Относительно низкая чувствительность по сравнению с лабораторными методами (ИФА, ПЦР);
• субъективность визуальной оценки (может зависеть от освещения, зрения оператора);
• ложноположительные результаты при перекрёстных реакциях;
• ложные отрицательные результаты при низкой концентрации аналита или нарушении процедуры;
• ограниченный диапазон количественного определения.

Критика и ограничения

Несмотря на широкое распространение, ИХА подвергается критике за недостаточную точность в некоторых областях. Например, при диагностике COVID-19 экспресс-тесты на антигены имеют чувствительность 70–85% по сравнению с ПЦР, что приводит к пропуску части случаев. В наркологии тесты могут давать ложноположительные результаты при приёме некоторых лекарств (например, декстрометорфана, антибиотиков). В пищевой промышленности ИХА часто используется лишь как скрининговый метод, требующий подтверждения более точными методами (ВЭЖХ, масс-спектрометрия).

Перспективы развития

Современные направления развития ИХА включают:

• Улучшение чувствительности за счёт использования наночастиц (квантовые точки, магнитные наночастицы, углеродные нанотрубки);
• создание мультиплексных тестов с 10–20 и более аналитами;
• интеграцию с мобильными устройствами (смартфонами) для автоматической оценки и передачи данных;
• разработку тестов для определения новых биомаркеров (онкомаркеры, цитокины);
• использование в персонализированной медицине и домашней диагностике.

Источники

1. Постников Е.Б., Ермолаева Т.Н. Иммунохроматографический анализ: принципы, методы, применение. — М.: Научный мир, 2015.
2. Марков А.Г., Козлов А.В. Экспресс-диагностика инфекционных заболеваний: руководство для врачей. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2020.
3. Бутенко А.М., Смирнов В.В. Иммунохроматографические тесты в ветеринарии. — М.: Колос, 2018.
4. ГОСТ Р 54667-2011 «Тест-системы иммунохроматографические. Общие технические условия».
5. World Health Organization. Rapid diagnostic tests for infectious diseases. — Geneva: WHO, 2021.