Метод Hi-C

Метод Hi-C — это высокопроизводительный молекулярно-биологический метод, основанный на секвенировании ДНК, который позволяет картировать трёхмерную организацию хроматина в клеточном ядре. Метод выявляет пространственные взаимодействия между любыми участками генома, независимо от их линейного расстояния вдоль хромосомы, и используется для построения карт контактов хроматина (contact maps) с разрешением от нескольких мегабаз до отдельных нуклеосом.

История

Метод Hi-C был разработан в 2009 году группой исследователей под руководством Джоба Деккера (Job Dekker) и Нильса Гейзена (Nilesh Gaither) в Массачусетском технологическом институте и Университете Массачусетса. Он стал развитием более раннего метода 3C (Chromosome Conformation Capture), предложенного Деккером в 2002 году. В 3C использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР) для количественного анализа взаимодействия между двумя конкретными локусами. Hi-C, в отличие от 3C, заменил ПЦР на высокопроизводительное секвенирование, что позволило одновременно анализировать все возможные парные взаимодействия в геноме.

Первая экспериментальная реализация Hi-C была описана в статье «Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome» (2009), где были представлены карты контактов для человеческого генома с разрешением около 1 мегабазы. С тех пор метод многократно совершенствовался: были разработаны варианты с повышенным разрешением (Hi-C 2.0, Micro-C), с использованием различных рестриктаз и лигирования, а также протоколы для анализа единичных клеток (single-cell Hi-C).

Принцип метода

Метод Hi-C основан на фиксации пространственной структуры хроматина с помощью химического сшивания, последующего гидролиза ДНК, лигирования концов, находящихся в непосредственной близости, и секвенирования полученных химерных фрагментов.

Основные этапы

1. Фиксация (сшивание). Клетки обрабатывают формальдегидом, который образует ковалентные сшивки между белками и ДНК, а также между белками, находящимися в пространственной близости. Это «замораживает» трёхмерную структуру хроматина на момент фиксации.
2. Гидролиз (рестрикция). ДНК разрезают с помощью рестриктазы (например, HindIII или MboI) на короткие фрагменты. Выбор фермента определяет размер фрагментов и разрешение метода.
3. Маркировка концов. Концы разрезанных фрагментов заполняют биотинилированными нуклеотидами (например, биотинилированным dATP) с помощью фермента Кленова. Это позволяет впоследствии выделить только те фрагменты, которые участвовали в лигировании.
4. Лигирование. В условиях низкой концентрации ДНК (чтобы избежать случайных межмолекулярных контактов) проводят лигирование концов фрагментов, которые находятся в непосредственной пространственной близости. В результате образуются химерные молекулы, состоящие из двух первоначально не связанных участков генома.
5. Обратное сшивание. Сшивки разрушают (например, протеиназой K), и ДНК очищают.
6. Фрагментация и отбор. ДНК дополнительно фрагментируют (например, ультразвуком) до размера 300–500 пар оснований. Затем с помощью стрептавидиновых магнитных шариков отбирают фрагменты, содержащие биотиновую метку (то есть те, которые были лигированы).
7. Секвенирование. Отобранные фрагменты секвенируют с помощью высокопроизводительных платформ (например, Illumina). Получаются парные концевые чтения (paired-end reads), каждое из которых соответствует двум разным участкам генома, взаимодействовавшим в пространстве.

Биоинформатический анализ

Обработка данных Hi-C включает несколько этапов:

1. Выравнивание (alignment). Парные чтения выравнивают на референсный геном. Чтения, которые выравниваются на один и тот же фрагмент рестрикции, считаются «нелигированными» и отбрасываются.
2. Фильтрация. Удаляются чтения, выравнивающиеся на повторы, митохондриальную ДНК, а также чтения с низким качеством.
3. Построение матрицы контактов. Для каждой пары геномных участков (бинов) подсчитывается количество пар чтений, которые их соединяют. Получается квадратная матрица, где строки и столбцы соответствуют участкам генома, а ячейки — числу контактов между ними.
4. Нормализация. Матрицы контактов подвергаются нормализации для устранения систематических ошибок, связанных с длиной фрагментов, GC-составом, доступностью рестриктазы и неравномерностью секвенирования. Наиболее распространённые методы нормализации — ICE (Iterative Correction and Eigenvector decomposition) и KR (Knight-Ruiz).
5. Визуализация. Матрицы контактов визуализируют в виде тепловых карт (contact maps), где оси представляют линейные координаты генома, а цвет ячейки — силу взаимодействия. Типичные паттерны на картах включают:

• Диагональ: сильные контакты между близлежащими участками, обусловленные линейной близостью.
• Топологически ассоциированные домены (TADs): блоки на карте, где контакты внутри блока значительно сильнее, чем между блоками. TADs — фундаментальные единицы организации хроматина у млекопитающих.
• Петли (loops): точки на карте, где два удалённых участка имеют аномально высокое число контактов, часто связанные с взаимодействием промоторов и энхансеров.
• Компартменты (compartments): крупномасштабные структуры размером в десятки мегабаз, разделяющие геном на активные (A-компартмент) и неактивные (B-компартмент) регионы.

Применение

Метод Hi-C широко используется в различных областях геномики и молекулярной биологии:

• Изучение трёхмерной архитектуры генома. Hi-C позволяет выявлять TADs, петли, компартменты и другие структуры, а также изучать их динамику в разных типах клеток, на разных стадиях развития и при заболеваниях.
• Идентификация регуляторных элементов. Анализ петель хроматина помогает находить энхансеры, промоторы и их взаимодействия, что важно для понимания механизмов регуляции экспрессии генов.
• Сборка геномов de novo. Hi-C-данные используются для упорядочивания и ориентации контигов (сборок) при сборке геномов, особенно для сложных геномов с большим количеством повторов. Метод позволяет «сшивать» контиги в хромосомы на основе карт контактов.
• Исследование хромосомных перестроек. Hi-C может выявлять транслокации, инверсии, делеции и дупликации, которые изменяют трёхмерную структуру хроматина. Это используется в диагностике рака и наследственных заболеваний.
• Изучение влияния генетических вариантов. Hi-C помогает понять, как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и другие варианты влияют на трёхмерную организацию генома и, следовательно, на экспрессию генов, что важно для изучения генетики сложных признаков.
• Эпигенетика. Hi-C позволяет связать трёхмерную структуру хроматина с эпигенетическими модификациями (например, метилированием ДНК, модификациями гистонов) и активностью транскрипции.

Разновидности метода

• Micro-C (или Hi-C с нуклеазой MNase). Вместо рестриктазы используется микрококковая нуклеаза (MNase), которая гидролизует ДНК между нуклеосомами. Это позволяет достичь нуклеосомного разрешения (около 200 пар оснований).
• Single-cell Hi-C. Адаптация метода для анализа трёхмерной структуры хроматина в единичных клетках. Позволяет изучать клеточную гетерогенность и динамику структуры в индивидуальных клетках.
• HiChIP (или PLAC-seq). Комбинация Hi-C и иммунопреципитации хроматина (ChIP). Позволяет выявлять взаимодействия, в которых участвует конкретный белок (например, гистоновая модификация или фактор транскрипции).
• Capture Hi-C (cHi-C). Hi-C с обогащением целевых участков (например, промоторов) с помощью гибридизации с биотинилированными зондами. Позволяет детально изучать взаимодействия конкретных регионов.
• Hi-C в 3D (3D Hi-C). Метод, позволяющий визуализировать трёхмерную структуру хроматина в фиксированных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии, дополняя Hi-C-данные.

Ограничения и критика

• Разрешение. Стандартный Hi-C имеет ограниченное разрешение (обычно 1–10 тысяч пар оснований), что не позволяет изучать взаимодействия на уровне отдельных нуклеосом без специальных модификаций (Micro-C).
• Специфичность. Метод выявляет только парные взаимодействия, а не тройные или более сложные контакты, хотя существуют методы для анализа мультиплексных взаимодействий (например, Tri-C, MC-3C).
• Артефакты. Возможны артефакты, связанные с неспецифическим сшиванием, случайным лигированием, GC-составом и неравномерностью секвенирования. Нормализация частично решает эту проблему, но не полностью.
• Стоимость. Высокопроизводительное секвенирование для Hi-C требует значительных финансовых затрат, особенно при высоком разрешении.
• Интерпретация. Биологическая интерпретация карт контактов сложна и требует интеграции с другими данными (эпигенетика, транскриптомика, данные о белках).

Источники

1. Lieberman-Aiden, E., et al. (2009). Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science, 326(5950), 289–293.
2. Rao, S. S. P., et al. (2014). A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell, 159(7), 1665–1680.
3. Dixon, J. R., et al. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature, 485(7398), 376–380.
4. Dekker, J., et al. (2013). Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nature Reviews Genetics, 14(6), 390–403.
5. Hsieh, T. H. S., et al. (2015). Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell, 162(1), 108–119.
6. Nagano, T., et al. (2013). Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature, 502(7469), 59–64.
7. Mumbach, M. R., et al. (2016). HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods, 13(11), 919–922.
8. Dryden, N. H., et al. (2014). Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research, 24(11), 1854–1868.
9. Imakaev, M., et al. (2012). Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods, 9(10), 999–1003.
10. Knight, P. A., & Ruiz, D. (2013). A fast algorithm for matrix balancing. IMA Journal of Numerical Analysis, 33(3), 1029–1047.