MLPA

MLPA (от англ. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification — мультиплексная амплификация, зависимая от лигирования зондов) — это молекулярно-генетический метод, предназначенный для выявления количественных изменений числа копий последовательностей ДНК (делеций и дупликаций) в нескольких локусах генома одновременно. Метод основан на гибридизации специфических зондов с целевыми участками ДНК, их лигировании и последующей амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). MLPA позволяет анализировать до 50–60 различных участков генома в одной реакции, что делает его эффективным инструментом для диагностики наследственных заболеваний, вызванных вариациями числа копий (CNV).

История

Метод MLPA был разработан в 2002 году группой учёных под руководством Яна Шаутена (Jan Schouten) в Нидерландах. Первоначально технология была создана для диагностики спинальной мышечной атрофии (СМА), вызванной делециями в гене SMN1. В 2005 году компания MRC-Holland (Нидерланды) начала коммерческое производство наборов для MLPA, что способствовало его широкому внедрению в клиническую практику. С течением времени метод был адаптирован для анализа различных генетических нарушений, включая синдромы микроделеций, анэуплоидии и мутации в генах предрасположенности к раку.

Принцип метода

MLPA сочетает в себе гибридизацию, лигирование и амплификацию. Основные этапы включают:

1. Денатурация ДНК: образец геномной ДНК нагревают до 98 °C для разделения двухцепочечной молекулы на одноцепочечные фрагменты.
2. Гибридизация зондов: к денатурированной ДНК добавляют смесь специфических зондов. Каждый зонд состоит из двух частей (левого и правого олигонуклеотида), которые гибридизуются с соседними участками целевой последовательности. Длина зондов варьируется, что позволяет разделять продукты амплификации по размеру.
3. Лигирование: после гибридизации к смеси добавляют лигазу. Если обе части зонда точно совпали с целевой последовательностью, лигаза соединяет их в единую молекулу. Если в целевом участке присутствует делеция или мутация, лигирование не происходит.
4. Амплификация: лигированные зонды амплифицируют с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров, меченных флуоресцентными красителями.
5. Фрагментный анализ: продукты амплификации разделяют методом капиллярного электрофореза. Количество флуоресцентного сигнала для каждого зонда пропорционально числу копий целевого участка в образце.

Классификация и виды

MLPA можно классифицировать по типу анализируемых мишеней:

• Стандартная MLPA: используется для выявления делеций и дупликаций в определённых генах или хромосомных регионах.
• MLPA для метилирования: модификация метода, позволяющая анализировать статус метилирования CpG-островков в промоторных областях генов. Включает обработку ДНК рестриктазами, чувствительными к метилированию.
• MLPA для анализа экспрессии: вариант, при котором в качестве матрицы используется кДНК, что позволяет оценивать относительные уровни экспрессии генов.

Применение

MLPA широко используется в клинической генетике и молекулярной диагностике:

• Диагностика наследственных заболеваний: выявление делеций и дупликаций в генах, связанных с муковисцидозом (CFTR), мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера (DMD), гемофилией (F8, F9) и другими.
• Онкогенетика: анализ числа копий генов-супрессоров опухолей (например, BRCA1, BRCA2, TP53) и онкогенов (HER2/neu) в образцах опухолевой ткани.
• Пренатальная диагностика: выявление анеуплоидий (синдром Дауна, Эдвардса, Патау) и микроделеционных синдромов (синдром ДиДжорджи, Вильямса, Прадера-Вилли).
• Фармакогенетика: определение числа копий генов, участвующих в метаболизме лекарственных средств (например, CYP2D6).

Преимущества и ограничения

Преимущества:

• Высокая пропускная способность: одновременный анализ до 50–60 локусов.
• Относительно низкая стоимость по сравнению с полноэкзомным или полногеномным секвенированием.
• Не требует большого количества ДНК (от 20 до 100 нг).
• Высокая чувствительность и специфичность для выявления делеций и дупликаций.

Ограничения:

• Не выявляет точковые мутации, небольшие инсерции/делеции (менее 1–2 нуклеотидов).
• Не позволяет определять точные границы делеций/дупликаций.
• Чувствительность к качеству ДНК и наличию ингибиторов ПЦР.
• Не подходит для анализа сложных хромосомных перестроек.

Сравнение с другими методами

MLPA занимает промежуточное положение между стандартной ПЦР и хромосомным микроматричным анализом (CMA). В отличие от ПЦР, MLPA позволяет одновременно анализировать несколько локусов, но, в отличие от CMA, не даёт информации о точных координатах CNV. По сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), MLPA не требует метафазных хромосом и может быть автоматизирован.

Интересные факты

• MLPA был разработан для диагностики спинальной мышечной атрофии, где делеции в гене SMN1 встречаются в 95% случаев.
• Метод позволяет выявлять мозаицизм (наличие нескольких клеточных линий с разным числом копий) при уровне мутантных клеток от 10–20%.
• Существуют коммерческие наборы для MLPA, покрывающие более 300 различных генов и хромосомных регионов.

Источники

• Schouten, J. P., et al. (2002). "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification." Nucleic Acids Research, 30(12), e57.
• MRC-Holland. (2023). "MLPA General Protocol." https://www.mrcholland.com
• Lalic, T., et al. (2016). "Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in clinical diagnostics." Journal of Medical Biochemistry, 35(3), 263–271.
• Российские клинические рекомендации по диагностике наследственных заболеваний (2020–2023).