Приготовление гистологических препаратов¶

Приготовление гистологических препаратов — это комплекс методических операций, направленных на получение из биологических тканей тонких срезов или мазков, пригодных для микроскопического исследования. Основная цель процесса — сохранить структуру клеток и межклеточного вещества максимально близкой к прижизненному состоянию, обеспечив при этом достаточную контрастность для визуализации в световом или электронном микроскопе.

¶Основные этапы приготовления

Процесс приготовления классического гистологического препарата включает несколько последовательных стадий, каждая из которых влияет на качество конечного результата.

¶Забор материала и фиксация

Первым этапом является взятие образца ткани (биопсия, аутопсия или экспериментальный материал). Кусочки ткани должны быть небольшими (обычно 0,5–1 см³) для быстрого проникновения фиксатора. Фиксация предотвращает аутолиз (самопереваривание) и гниение, стабилизирует белки. Наиболее распространённый фиксатор — 10% нейтральный забуференный формалин. Длительность фиксации варьируется от нескольких часов до суток в зависимости от размера образца.

¶Проводка (обезвоживание)

После фиксации ткань необходимо обезводить, так как большинство сред для заливки (парафин) несмешиваемы с водой. Проводка осуществляется через серию спиртов возрастающей концентрации (70%, 80%, 96%, 100%) и затем через органические растворители (ксилол, хлороформ), которые вытесняют спирт и делают ткань прозрачной. Этот этап также называют обезвоживанием и просветлением.

¶Заливка

Обезвоженный образец пропитывают расплавленным парафином при температуре 56–58 °C. После остывания парафин затвердевает, образуя твёрдый блок, который можно закрепить в микротоме. Альтернативой парафину служат целлоидин, смолы (для электронной микроскопии) или заморозка (криостат). Криостатные срезы готовят из замороженных тканей без заливки, что значительно ускоряет процесс, но ухудшает сохранность деталей.

¶Микротомия (резка)

Срезы получают на микротоме — приборе, обеспечивающем точную толщину среза. Для световой микроскопии стандартная толщина составляет 4–7 мкм. Срезы снимают с ножа специальной кисточкой, расправляют на поверхности тёплой воды (40–45 °C) и переносят на предметное стекло. Для лучшей адгезии стёкла обрабатывают адгезивами (например, поли-L-лизином).

¶Окрашивание

Перед окрашиванием парафин из срезов удаляют (депарафинизация) путём прохождения через ксилол и спирты в обратном порядке. Наиболее распространённый метод — окраска гематоксилином и эозином (ГЭ). Гематоксилин окрашивает ядра клеток в сине-фиолетовый цвет, а эозин — цитоплазму и внеклеточный матрикс в розовый. Существуют и специальные методы: окраска по Ван Гизону (коллаген), по Романовскому-Гимзе (кровь), импрегнация серебром (нервная ткань), ШИК-реакция (гликоген и нейтральные мукополисахариды).

¶Заключение

Окрашенный срез заключают в оптически прозрачную среду (бальзам, полистирол, синтетические смолы) под покровное стекло. Заключение обеспечивает сохранность препарата на долгие годы и улучшает оптические свойства.

¶Специальные виды препаратов

Помимо классических парафиновых срезов, существуют другие формы гистологических препаратов:

Мазки — используются для исследования жидких тканей (кровь, костный мозг) или клеточных суспензий.
Отпечатки — получают прикосновением предметного стекла к поверхности органа (например, при интраоперационной диагностике).
Полутонкие срезы — толщиной 0,5–1 мкм, получаемые из блоков, залитых в эпоксидные смолы, для световой микроскопии высокого разрешения.
Ультратонкие срезы — толщиной 50–100 нм, получаемые на ультрамикротоме с использованием стеклянных или алмазных ножей, для трансмиссионной электронной микроскопии.

¶Быстрые методы (экспресс-диагностика)

В интраоперационной практике используется ускоренный метод: ткань замораживают в криостате при температуре −20…−30 °C, нарезают и окрашивают в течение 10–15 минут. Это позволяет хирургу получить ответ о характере патологического процесса прямо во время операции.

¶Ошибки и артефакты

Качество препарата зависит от соблюдения технологии. Типичные артефакты включают: перефиксацию (чрезмерное уплотнение ткани), образование кристаллов формалина, неровную толщину среза, складки ткани, пузырьки воздуха под покровным стеклом, неполную депарафинизацию. Некорректная фиксация может привести к ложным результатам иммуногистохимического исследования.

¶Применение

Приготовление гистологических препаратов является базовым методом в патологической анатомии (диагностика опухолей, воспалительных заболеваний), эмбриологии, токсикологии, ветеринарии и экспериментальной биологии. На основе окрашенных препаратов проводят морфометрический анализ, иммуногистохимию и молекулярно-биологические исследования (FISH, гибридизация in situ).