Радиоиммунный анализ

Радиоиммунный анализ (РИА, радиоиммунологический анализ, англ. radioimmunoassay, RIA) — это метод количественного определения биологически активных веществ (антигенов, гормонов, ферментов, лекарственных препаратов) в образцах биологических жидкостей, основанный на конкурентном связывании анализируемого вещества и его радиоактивно меченого аналога со специфическими антителами. Метод отличается высокой чувствительностью (до пико- и фемтомолярных концентраций) и специфичностью, что позволяет определять вещества в крайне малых количествах (10⁻⁹–10⁻¹² г/мл). Разработан в 1959–1960 годах американскими исследователями Розалин Сасмен Ялоу и Соломоном Берсоном, за что Ялоу в 1977 году была удостоена Нобелевской премии по физиологии и медицине.

История

Предпосылкой к созданию РИА стали исследования по изучению метаболизма инсулина у больных сахарным диабетом. В 1950-х годах Ялоу и Берсон, работавшие в Бронксе (Нью-Йорк), обнаружили, что у пациентов, получавших инсулин, в крови образуются антитела к этому гормону. Они предположили, что если пометить инсулин радиоактивным изотопом (например, йодом-131), то можно измерить количество связавшегося с антителами меченого инсулина и, используя принцип конкуренции, определить концентрацию немеченого инсулина в образце.

Первая публикация, описывающая метод, вышла в 1960 году в журнале Journal of Clinical Investigation. Первоначально метод применялся исключительно для измерения инсулина, но вскоре его адаптировали для десятков других гормонов, витаминов, ферментов и лекарственных средств. В 1977 году Розалин Ялоу стала лауреатом Нобелевской премии (Берсон скончался в 1972 году и не мог быть номинирован). В 1970–1980-х годах РИА стал «золотым стандартом» клинической лабораторной диагностики, однако впоследствии был частично вытеснен более безопасными нерадиоактивными методами (иммуноферментный анализ, ИФА; хемилюминесцентный анализ).

Принцип метода

РИА основан на конкурентном иммунохимическом взаимодействии. В системе присутствуют три ключевых компонента:

1. Специфические антитела (в избытке или в фиксированном количестве), способные связываться с определяемым веществом (антигеном).
2. Анализируемый образец (содержит неизвестное количество немеченого антигена).
3. Радиоактивно меченый антиген (трассер) — то же вещество, но с ковалентно присоединённым радиоактивным изотопом (обычно ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C).

Смесь инкубируется до достижения равновесия. В ходе реакции немеченый антиген из образца и меченый трассер конкурируют за ограниченное количество мест связывания на антителах. После инкубации связавшуюся с антителами фракцию отделяют от свободной (несвязавшейся) — например, осаждением, фильтрацией или адсорбцией. Затем измеряют радиоактивность осадка (связанной фракции) или супернатанта с помощью сцинтилляционного счётчика.

Чем больше немеченого антигена в образце, тем меньше меченого трассера связывается с антителами, и тем ниже радиоактивность связанной фракции. По калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов с известной концентрацией, рассчитывают концентрацию вещества в пробе.

Необходимые компоненты и оборудование

Для проведения РИА требуется:

• Радиоактивные изотопы: чаще всего йод-125 (¹²⁵I, период полураспада 60 дней) или тритий (³H, период полураспада 12,3 года). Выбор изотопа зависит от химической природы аналита и доступности детектирующего оборудования.
• Антитела: поликлональные (сыворотка иммунизированных животных) или моноклональные, с высокой аффинностью к антигену.
• Стандарты и контроли: серия разведений чистого вещества для построения калибровочной кривой.
• Реагенты для разделения: активированный уголь, полиэтиленгликоль, вторичные антитела или стафилококковый белок А.
• Радиоизотопное оборудование: гамма-счётчики (для ¹²⁵I) или жидкостные сцинтилляционные счётчики (для ³H, ¹⁴C).
• Средства радиационной защиты: свинцовые экраны, дозиметры, перчатки, контейнеры для радиоактивных отходов.

Виды и модификации

Существует несколько вариантов РИА, различающихся по схеме проведения:

• Классический конкурентный РИА (описан выше) — наиболее распространённый.
• Иммунорадиометрический анализ (ИРМА) — использует избыток меченых антител, а не меченого антигена. Чувствительность ИРМА обычно выше, чем у конкурентного РИА.
• Двухсайтовый (сэндвич-) РИА — применяется для крупных молекул (белков), имеющих два эпитопа. Один антитело иммобилизовано на твёрдой фазе, второе — меченое. Концентрация антигена пропорциональна радиоактивности связанного комплекса.
• Радиоиммуноадсорбентный анализ (RIST) — для определения антител, а не антигенов.

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Высокая чувствительность: позволяет измерять концентрации до 10⁻¹²–10⁻¹⁵ М.
• Высокая специфичность: благодаря использованию антител, метод способен различать структурно близкие соединения (например, тестостерон и дигидротестостерон).
• Широкий диапазон измерений: от пикограммов до микрограммов на миллилитр.
• Возможность анализа сложных биологических матриц (сыворотка, плазма, моча, ликвор) без предварительной очистки.

Недостатки

• Радиационная опасность: работа с радиоактивными изотопами требует специального разрешения, обучения персонала, лицензирования лаборатории и утилизации отходов.
• Короткий срок годности реагентов: из-за радиоактивного распада трассера (особенно ¹²⁵I).
• Необходимость дорогостоящего оборудования (счётчики, защитные камеры).
• Влияние матричных эффектов: белки крови, липиды и другие компоненты могут мешать связыванию.
• Постепенное вытеснение нерадиоактивными методами (ИФА, хемилюминесценция), которые безопаснее и проще в автоматизации.

Применение

Радиоиммунный анализ широко применялся и продолжает применяться в следующих областях:

• Эндокринология: определение уровня гормонов (тироксин, трийодтиронин, кортизол, инсулин, С-пептид, пролактин, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон, тестостерон, эстрадиол, прогестерон).
• Онкология: онкомаркеры (альфа-фетопротеин, раково-эмбриональный антиген, хорионический гонадотропин человека).
• Фармакология и токсикология: мониторинг концентрации лекарственных препаратов (дигоксин, теофиллин, циклоспорин, фенитоин) и наркотических веществ.
• Вирусология и иммунология: определение антигенов вирусов (гепатит B, ВИЧ) и аутоантител.
• Пищевая промышленность и сельское хозяйство: контроль содержания микотоксинов, пестицидов, гормонов роста в продуктах.
• Научные исследования: изучение метаболизма, рецепторного связывания, экспрессии генов.

Безопасность и регулирование

В Российской Федерации проведение РИА регламентируется санитарными правилами и нормами (СанПиН 2.6.1.2523-09 «Нормы радиационной безопасности»). Лаборатории, выполняющие РИА, должны иметь лицензию на работу с радиоактивными веществами, а персонал — проходить инструктаж и медицинский контроль. Радиоактивные отходы (использованные пробирки, фильтры, растворы) подлежат сбору, временному хранению и передаче специализированным организациям для захоронения. Из-за ужесточения требований к радиационной безопасности и развития альтернативных методов, объём применения РИА в клинической практике в России и мире сокращается, однако он сохраняется в научных лабораториях и специализированных центрах.

Интересные факты

• Розалин Ялоу была второй женщиной, получившей Нобелевскую премию по физиологии и медицине (после Герти Кори в 1947 году).
• Первоначально метод назывался «радиоиммунологический анализ», но в русскоязычной литературе закрепилось сокращение «радиоиммунный анализ».
• В 1970-х годах РИА использовался для обнаружения наркотиков у спортсменов на Олимпийских играх.
• Несмотря на вытеснение нерадиоактивными методами, РИА остаётся эталонным референтным методом для калибровки многих иммунохимических тест-систем.

Источники

• Yalow R.S., Berson S.A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. Journal of Clinical Investigation, 1960, 39: 1157–1175.
• Yalow R.S. Radioimmunoassay: a probe for the fine structure of biologic systems. Science, 1978, 200(4347): 1236–1245.
• Чиркин А.А., Коваленко В.И. Радиоиммунный анализ: теория и практика. М.: Медицина, 1983.
• СанПиН 2.6.1.2523-09 «Нормы радиационной безопасности (НРБ-99/2009)».
• Bolton A.E., Hunter W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivities by conjugation to a ¹²⁵I-containing acylating agent. Biochemical Journal, 1973, 133(3): 529–539.