5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза

5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза (EPSP-синтаза, КФ 2.5.1.19) — фермент из класса трансфераз, катализирующий шестую реакцию шикиматного пути — биосинтеза ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана) у растений, бактерий, грибов и некоторых протистов. У позвоночных животных шикиматный путь отсутствует. EPSP-синтаза является ключевой мишенью для гербицида глифосата (торговая марка «Раундап»), что делает её объектом интенсивных исследований в области сельскохозяйственной биотехнологии и создания генетически модифицированных культур, устойчивых к гербицидам.

История открытия и изучения

Шикиматный путь был впервые описан в 1950-х годах Бернардом Дэвисом и Дэвидом Спринсоном. EPSP-синтаза была идентифицирована в 1960-х годах как фермент, катализирующий конденсацию фосфоенолпирувата (PEP) и 3-фосфошикимата (S3P) с образованием 5-енолпирувилшикимат-3-фосфата (EPSP) и неорганического фосфата. В 1980-х годах было установлено, что глифосат ингибирует именно этот фермент, блокируя синтез ароматических аминокислот и вызывая гибель растений. В 1990-х годах была выделена и клонирована ген EPSP-синтазы из бактерии Agrobacterium tumefaciens (штамм CP4), что привело к созданию первых глифосат-устойчивых трансгенных культур (соя, кукуруза, хлопок).

Структура и механизм действия

Молекулярная структура

EPSP-синтаза представляет собой мономерный белок с молекулярной массой около 46–50 кДа (в зависимости от организма). У растений и бактерий фермент локализован в цитоплазме, а у растений — дополнительно в хлоропластах, куда он транспортируется с помощью N-концевой сигнальной последовательности. Кристаллическая структура EPSP-синтазы из Escherichia coli (разрешена в 1996 году) показала, что фермент состоит из двух доменов, образующих глубокую щель, где связываются субстраты и кофактор — ион магния (Mg²⁺).

Каталитический механизм

Реакция, катализируемая EPSP-синтазой, включает три стадии:

1. Связывание S3P — 3-фосфошикимат занимает активный центр, вызывая конформационные изменения фермента.
2. Присоединение PEP — фосфоенолпируват входит в активный центр, где его енольная группа атакует карбонильную группу S3P.
3. Элиминирование фосфата — отщепляется неорганический фосфат, и образуется продукт EPSP.

Реакция обратима, но в физиологических условиях сдвинута в сторону синтеза EPSP из-за последующего быстрого превращения EPSP в хоризмат (следующая реакция шикиматного пути). Кофактор Mg²⁺ стабилизирует отрицательный заряд на фосфатных группах субстратов.

Ингибирование глифосатом

Глифосат (N-фосфонометилглицин) является конкурентным ингибитором EPSP-синтазы по отношению к PEP. Молекула глифосата имитирует переходное состояние реакции, связываясь в активном центре фермента вместе с S3P. Это приводит к образованию стабильного тройного комплекса (фермент–S3P–глифосат), который блокирует дальнейшее протекание реакции. Ингибирование EPSP-синтазы вызывает накопление шикимата и его производных, что нарушает метаболизм растений и приводит к их гибели в течение нескольких дней.

Биологическая роль и распространение

EPSP-синтаза является одним из ключевых ферментов шикиматного пути, который обеспечивает синтез ароматических аминокислот, а также многих вторичных метаболитов: флавоноидов, лигнина, салициловой кислоты, алкалоидов и хинонов. У растений шикиматный путь особенно важен для фотосинтеза, роста и защиты от патогенов. У бактерий EPSP-синтаза участвует в синтезе убихинона и витамина K. У грибов — в синтезе меланинов и других пигментов.

Фермент обнаружен у всех организмов, обладающих шикиматным путём: высших растений, водорослей, цианобактерий, грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также у некоторых архей. У позвоночных, насекомых и других многоклеточных животных шикиматный путь отсутствует, поэтому EPSP-синтаза не является мишенью для лекарственных препаратов.

Применение в биотехнологии

Генетически модифицированные культуры

Наиболее известное применение EPSP-синтазы — создание трансгенных растений, устойчивых к глифосату. Для этого используется ген aroA из бактерии Agrobacterium tumefaciens (штамм CP4), кодирующий EPSP-синтазу, нечувствительную к глифосату. Введение этого гена в геном сои, кукурузы, хлопка, рапса, сахарной свёклы и других культур позволяет фермеру применять глифосат для борьбы с сорняками без повреждения посевов. Первая коммерческая глифосат-устойчивая соя (Roundup Ready) была выпущена в 1996 году компанией Monsanto (организация признана нежелательной в РФ). В России такие культуры официально разрешены к ввозу и использованию, но их коммерческое выращивание ограничено.

Альтернативные варианты фермента

Помимо CP4 EPSP-синтазы, существуют другие мутантные и химерные формы фермента, устойчивые к глифосату:

• G96A — мутация в EPSP-синтазе кукурузы, заменяющая глицин на аланин в положении 96.
• T102I/P106S — двойная мутация в EPSP-синтазе E. coli, повышающая устойчивость к глифосату в 1000 раз.
• AroA:Y — вариант из Pseudomonas fluorescens, обладающий высокой каталитической активностью и устойчивостью к глифосату.

Эти варианты используются в генной инженерии для создания культур с улучшенной устойчивостью к гербицидам.

Другие применения

EPSP-синтаза также используется в качестве репортёрного гена в молекулярной биологии, а её ингибиторы изучаются как потенциальные антибактериальные и антигрибковые препараты. Однако из-за высокой токсичности глифосата для человека и окружающей среды (по данным ВОЗ, глифосат классифицирован как «вероятно канцерогенный для человека» — группа 2A) его применение вызывает споры в научном сообществе.

Критика и ограничения

Использование глифосат-устойчивых культур на основе EPSP-синтазы CP4 связано с рядом экологических и агрономических проблем:

• Развитие устойчивости сорняков — к 2024 году зафиксировано более 50 видов сорняков, устойчивых к глифосату, что требует увеличения доз гербицида или применения комбинированных препаратов.
• Влияние на нецелевые организмы — глифосат может подавлять рост полезных почвенных бактерий, содержащих EPSP-синтазу, и нарушать симбиоз растений с микоризными грибами.
• Остаточные количества в продуктах — в некоторых исследованиях обнаружены следы глифосата в зерне сои и кукурузы, что вызывает опасения у потребителей.

В России с 2020 года действует запрет на использование глифосата для обработки сельскохозяйственных культур, предназначенных для производства детского питания, а также введены ограничения на его применение вблизи водоёмов.

Интересные факты

• EPSP-синтаза является одним из наиболее консервативных ферментов: у разных видов растений и бактерий последовательность аминокислот совпадает на 40–60%.
• Ген aroA из Agrobacterium tumefaciens CP4 был впервые выделен в 1985 году, и его структура была запатентована компанией Monsanto (организация признана нежелательной в РФ) для создания Roundup Ready культур.
• В 2013 году был открыт новый класс ингибиторов EPSP-синтазы — производные сульфонилмочевины, которые действуют на фермент иначе, чем глифосат, и могут быть использованы для борьбы с устойчивыми сорняками.

Источники

• Bentley R. The shikimate pathway — a metabolic tree with many branches // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. — 1990. — Vol. 25, № 5. — P. 307–384.
• Steinrücken H. C., Amrhein N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1980. — Vol. 94, № 4. — P. 1207–1212.
• Padgette S. R. et al. Site-directed mutagenesis of a conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site // Journal of Biological Chemistry. — 1991. — Vol. 266, № 33. — P. 22364–22369.
• Funke T. et al. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2006. — Vol. 103, № 35. — P. 13010–13015.
• Всемирная организация здравоохранения. Glyphosate: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. — 2015. — Vol. 112.
• Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор). Перечень пестицидов и агрохимикатов, разрешённых к применению на территории РФ. — 2024.