Альтернативный сплайсинг

Альтернативный сплайсинг — это процесс, при котором из одной молекулы пре-матричной РНК (пре-мРНК) в результате различных комбинаций соединения экзонов (кодирующих участков) и удаления интронов (некодирующих участков) образуется несколько различных зрелых матричных РНК (мРНК). Этот механизм позволяет одному гену кодировать множество различных белковых изоформ, значительно расширяя разнообразие протеома без увеличения числа генов в геноме. Альтернативный сплайсинг является ключевым механизмом регуляции экспрессии генов у эукариот, особенно у многоклеточных организмов.

История открытия

Концепция альтернативного сплайсинга была впервые предложена в 1977 году, когда независимо друг от друга группы исследователей под руководством Ричарда Робертса и Филлипа Шарпа обнаружили, что гены аденовирусов имеют прерывистую структуру, а их мРНК образуется путем соединения разрозненных участков ДНК. За это открытие в 1993 году они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

В 1980-х годах были выявлены первые примеры альтернативного сплайсинга у эукариот. В 1981 году было показано, что ген кальцитонина у человека может продуцировать две разные мРНК: одну, кодирующую кальцитонин, и другую, кодирующую кальцитонин-ген-родственный пептид (CGRP). Это стало первым доказательством альтернативного сплайсинга у позвоночных.

В 1990-х годах с развитием методов секвенирования ДНК и биоинформатики стало очевидно, что альтернативный сплайсинг является широко распространенным явлением. В 2000-х годах проекты по секвенированию генома человека показали, что более 95% генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу.

Механизм сплайсинга

Основной (конститутивный) сплайсинг

Сплайсинг катализируется сплайсосомой — большим рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из малых ядерных РНК (snRNA) и белков. Сплайсосома распознает консервативные последовательности на границах экзонов и интронов: донорный сайт (5'-конец интрона), акцепторный сайт (3'-конец интрона) и точку ветвления (участок внутри интрона, содержащий аденин). В ходе конститутивного сплайсинга все интроны удаляются, а экзоны соединяются в строго определенном порядке, образуя единственную зрелую мРНК.

Типы альтернативного сплайсинга

Существует несколько основных типов альтернативного сплайсинга:

1. Пропуск экзона (exon skipping) — наиболее распространенный тип у позвоночных. Экзон может быть либо включен в зрелую мРНК, либо исключен из нее. Например, ген DSCAM у дрозофилы может продуцировать до 38 016 различных изоформ за счет пропуска экзонов.

1. Взаимоисключающие экзоны — из набора экзонов в зрелую мРНК включается только один. Примером служит ген α-тропомиозина, где из нескольких вариантов экзонов выбирается один.

1. Альтернативный донорный сайт — использование другого 5'-сайта сплайсинга, что приводит к удлинению или укорочению экзона.

1. Альтернативный акцепторный сайт — использование другого 3'-сайта сплайсинга, аналогично изменяющее длину экзона.

1. Удержание интрона (intron retention) — интрон не удаляется и остается в составе зрелой мРНК. Этот тип чаще встречается у растений и низших эукариот, но также наблюдается у млекопитающих.

1. Альтернативный промотор — использование разных промоторов приводит к включению различных первых экзонов.

1. Альтернативный полиаденилирование — использование разных сайтов полиаденилирования, что влияет на длину 3'-нетранслируемой области (3'-UTR).

Регуляция альтернативного сплайсинга

Альтернативный сплайсинг регулируется множеством факторов, которые взаимодействуют с пре-мРНК и сплайсосомой.

Цис-регуляторные элементы

На пре-мРНК существуют последовательности, которые усиливают или подавляют сплайсинг в определенных сайтах:

• Энхансеры сплайсинга — последовательности, которые привлекают активаторы сплайсинга. Различают экзонные энхансеры сплайсинга (ESE) и интронные энхансеры сплайсинга (ISE).
• Сайленсеры сплайсинга — последовательности, которые подавляют сплайсинг. Различают экзонные сайленсеры сплайсинга (ESS) и интронные сайленсеры сплайсинга (ISS).

Транс-факторы

Белковые факторы, связывающиеся с цис-элементами, включают:

• Семейство SR-белков (белки, богатые серином и аргинином) — обычно активируют сплайсинг, связываясь с ESE.
• Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNP) — часто подавляют сплайсинг, связываясь с ESS или ISS.

Соотношение и активность этих факторов в клетке определяют, какой вариант сплайсинга будет реализован. Регуляция может быть тканеспецифичной, стадийно-специфичной или зависеть от внешних сигналов.

Роль в биологии

Расширение протеома

Альтернативный сплайсинг является основным механизмом, увеличивающим сложность протеома. У человека, по разным оценкам, около 20 000 генов кодируют более 100 000 различных белковых изоформ. Например, ген Neurexin у человека может продуцировать тысячи различных изоформ, участвующих в формировании синапсов.

Тканеспецифичная экспрессия

Многие гены подвергаются альтернативному сплайсингу тканеспецифичным образом. Например, ген PKM (пируваткиназа M) продуцирует изоформу PKM1 в тканях, требующих аэробного метаболизма (мозг, мышцы), и изоформу PKM2 в пролиферирующих клетках и опухолях.

Развитие и дифференцировка

Альтернативный сплайсинг играет критическую роль в эмбриональном развитии. Например, ген DSCAM у дрозофилы необходим для правильного формирования нейронных цепей. Мутации, нарушающие альтернативный сплайсинг, могут приводить к летальным исходам или тяжелым порокам развития.

Адаптация и эволюция

Альтернативный сплайсинг предоставляет эволюционный материал для появления новых функций белков. Изменения в паттернах сплайсинга могут быть более эволюционно значимыми, чем изменения в последовательностях самих белков. Например, у позвоночных альтернативный сплайсинг чаще встречается в генах, связанных с иммунной системой и нервной системой, что отражает эволюционную адаптацию к сложным условиям.

Клиническое значение

Нарушения сплайсинга и заболевания

Мутации, затрагивающие сайты сплайсинга или регуляторные элементы, могут вызывать различные заболевания:

• Спинальная мышечная атрофия (СМА) — вызвана делецией или мутацией гена SMN1, что приводит к нарушению сплайсинга и дефициту белка SMN. Заболевание характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью и атрофией.
• Миотоническая дистрофия 1 типа — вызвана экспансией тринуклеотидных повторов в гене DMPK, что приводит к секвестрации белков-регуляторов сплайсинга и множественным нарушениям сплайсинга.
• Муковисцидоз — некоторые мутации в гене CFTR нарушают сплайсинг, приводя к дефектному белку и тяжелым нарушениям работы легких и поджелудочной железы.
• Рак — при многих видах рака наблюдаются аберрантные паттерны сплайсинга, которые могут способствовать пролиферации опухолевых клеток, метастазированию и устойчивости к терапии. Например, изоформа PKM2 часто экспрессируется в опухолях.

Терапевтические подходы

Разрабатываются стратегии коррекции нарушений сплайсинга:

• Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) — короткие синтетические молекулы, которые связываются с пре-мРНК и изменяют паттерн сплайсинга. Например, препарат нусинерсен (Spinraza) используется для лечения спинальной мышечной атрофии, корректируя сплайсинг гена SMN2.
• Малые молекулы — некоторые соединения могут модулировать активность факторов сплайсинга. Например, рилозол показал способность изменять сплайсинг гена SMN2.
• Генная терапия — доставка нормальных копий генов или редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9 для исправления мутаций, нарушающих сплайсинг.

Исследовательские методы

Для изучения альтернативного сплайсинга используются различные подходы:

• Секвенирование РНК (RNA-seq) — позволяет выявить все варианты сплайсинга в образце. Современные методы, такие как длинночитающее секвенирование (PacBio, Oxford Nanopore), позволяют напрямую определять полные изоформы мРНК.
• Микрочипы сплайсинга — специализированные микрочипы, содержащие зонды для различных экзон-экзонных соединений.
• ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) — позволяет амплифицировать и анализировать конкретные варианты сплайсинга.
• Биоинформатический анализ — программы, такие как rMATS, MISO и SUPPA, используются для идентификации и количественной оценки дифференциального сплайсинга из данных RNA-seq.

Примеры в природе

Дрозофила (Drosophila melanogaster)

Ген DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule) у дрозофилы может продуцировать до 38 016 различных изоформ за счет альтернативного сплайсинга четырех кластеров экзонов. Этот механизм обеспечивает уникальную идентичность каждого нейрона и необходим для правильного формирования нейронных цепей.

Человек

• **Ген *CD44*** — кодирует рецептор гиалуроновой кислоты, участвующий в клеточной адгезии и миграции. Альтернативный сплайсинг продуцирует множество изоформ, некоторые из которых ассоциированы с метастазированием рака.
• **Ген *Bcl-x*** — кодирует белки, регулирующие апоптоз. Изоформа Bcl-xL подавляет апоптоз, а Bcl-xS — активирует. Соотношение этих изоформ определяет выживаемость клеток.

Растения

У растений альтернативный сплайсинг часто связан с ответом на стрессовые условия. Например, у арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) ген SR30 подвергается альтернативному сплайсингу в ответ на изменение температуры, что влияет на регуляцию цветения.

Источники

• Alberts B., Johnson A., Lewis J., et al. Molecular Biology of the Cell. 6th edition. Garland Science, 2014.
• Black D.L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry, 2003, 72: 291-336.
• Nilsen T.W., Graveley B.R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature, 2010, 463(7280): 457-463.
• Wang E.T., Sandberg R., Luo S., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature, 2008, 456(7221): 470-476.
• Pan Q., Shai O., Lee L.J., et al. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics, 2008, 40(12): 1413-1415.
• Scotti M.M., Swanson M.S. RNA mis-splicing in disease. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(1): 19-32.
• Kalsotra A., Cooper T.A. Functional consequences of developmentally regulated alternative splicing. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(11): 715-729.