Дигидрофолатредуктаза

Дигидрофолатредуктаза (ДГФР, англ. dihydrofolate reductase, DHFR) — это фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий восстановление дигидрофолиевой кислоты (дигидрофолата) до тетрагидрофолиевой кислоты (тетрагидрофолата) с использованием кофермента НАДФН. Данная реакция является ключевым этапом в метаболизме фолиевой кислоты, необходимой для синтеза пуриновых нуклеотидов, тимидилата и некоторых аминокислот. ДГФР присутствует во всех живых организмах — от бактерий до человека, и её ингибирование используется в медицине как механизм действия ряда антибактериальных, противопротозойных и противоопухолевых препаратов.

История открытия и изучения

Фермент был впервые выделен и охарактеризован в 1950-х годах в ходе исследований метаболизма фолиевой кислоты. В 1948 году американский биохимик Джордж Хитчингс и его коллеги из компании Burroughs Wellcome (ныне часть GlaxoSmithKline) начали систематический поиск ингибиторов ферментов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот. В 1951 году они синтезировали диаминопиримидиновые соединения, которые позже были идентифицированы как ингибиторы ДГФР. В 1957 году был открыт метотрексат — мощный ингибитор ДГФР, ставший одним из первых противоопухолевых химиотерапевтических средств. В 1960-х годах структура фермента была определена методами рентгеновской кристаллографии, что позволило понять механизм катализа и взаимодействия с ингибиторами. За работы по изучению ДГФР и разработке антиметаболитов Джордж Хитчингс и Гертруда Элайон были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1988 году.

Структура и механизм действия

Молекулярная структура

Дигидрофолатредуктаза представляет собой небольшой мономерный белок с молекулярной массой около 18–25 кДа (в зависимости от организма). Фермент состоит из одной полипептидной цепи, которая сворачивается в глобулярную структуру, содержащую восемь β-складчатых листов и четыре α-спирали. Активный центр расположен в глубокой щели, образованной этими вторичными структурами. Ключевые аминокислотные остатки активного центра включают аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и несколько ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин), которые участвуют в связывании субстрата и кофермента.

Каталитический механизм

Реакция, катализируемая ДГФР, протекает в две стадии:

1. Связывание дигидрофолата и НАДФН в активном центре.
2. Перенос гидрид-иона (H⁻) от НАДФН к атому углерода C6 дигидрофолата, что приводит к восстановлению пиразинового кольца и образованию тетрагидрофолата.

Тетрагидрофолат является коферментом для ряда ферментов, участвующих в переносе одноуглеродных фрагментов (метильных, формильных, метиленовых групп). Эти реакции необходимы для синтеза ДНК, РНК и аминокислот. Без активной ДГФР клетка не может производить достаточное количество тимидилата и пуринов, что приводит к остановке клеточного цикла и гибели клетки.

Биологическая роль

Участие в метаболизме фолатов

ДГФР является центральным ферментом фолатного цикла. В клетках фолиевая кислота (витамин B9) сначала восстанавливается до дигидрофолата под действием дигидрофолатсинтазы, а затем ДГФР превращает его в тетрагидрофолат. Тетрагидрофолат далее используется в следующих процессах:

• Синтез тимидилата (dTMP) из дезоксиуридилата (dUMP) — ключевая реакция для репликации ДНК.
• Синтез пуриновых нуклеотидов (аденина и гуанина).
• Метаболизм аминокислот: серина, глицина, метионина и гистидина.

Значение для пролиферации клеток

В быстро делящихся клетках (например, в эмбриональных тканях, клетках костного мозга, эпителии кишечника и опухолевых клетках) потребность в нуклеотидах резко возрастает, что делает ДГФР критически важным ферментом. Ингибирование ДГФР приводит к дефициту тимидилата и пуринов, что вызывает остановку клеточного цикла в S-фазе и апоптоз. Это свойство используется в химиотерапии рака.

Ингибиторы дигидрофолатредуктазы

Ингибиторы ДГФР являются важным классом лекарственных средств, применяемых в различных областях медицины. По механизму действия они делятся на конкурентные (связываются с активным центром, блокируя доступ субстрата) и неконкурентные (связываются с другими участками фермента). Наиболее изучены конкурентные ингибиторы, структурно напоминающие фолиевую кислоту.

Антибактериальные ингибиторы

• Триметоприм — селективный ингибитор бактериальной ДГФР. Используется в комбинации с сульфаметоксазолом (ко-тримоксазол) для лечения инфекций мочевыводящих путей, дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта. Триметоприм в 50 000 раз сильнее ингибирует бактериальную ДГФР, чем человеческую, что обеспечивает избирательность действия.
• Метоприн — ингибитор ДГФР у некоторых грамположительных бактерий, применяется реже.

Противопротозойные ингибиторы

• Пириметамин — используется для лечения токсоплазмоза и малярии. Ингибирует ДГФР простейших (например, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii). Часто применяется в комбинации с сульфадиазином.
• Прогуанил — пролекарство, метаболизирующееся в активный метаболит циклогуанил, который ингибирует ДГФР малярийного плазмодия.

Противоопухолевые ингибиторы

• Метотрексат — классический противоопухолевый препарат, ингибирующий ДГФР человека. Применяется при лечении лейкозов, лимфом, рака молочной железы, остеосаркомы. Также используется в высоких дозах при ревматоидном артрите и псориазе.
• Пеметрексед — ингибитор нескольких ферментов фолатного цикла, включая ДГФР, тимидилатсинтазу и глицинамидриботидформилтрансферазу. Применяется при немелкоклеточном раке лёгкого и мезотелиоме.
• Радотрексед — селективный ингибитор ДГФР, используется в терапии некоторых солидных опухолей, но имеет ограниченное применение из-за токсичности.

Ингибиторы для лечения аутоиммунных заболеваний

Метотрексат в низких дозах (7,5–25 мг в неделю) является базисным препаратом для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита и других аутоиммунных заболеваний. Механизм действия в данном случае не полностью связан с ингибированием ДГФР, но включает также противовоспалительные эффекты через накопление аденозина.

Резистентность к ингибиторам

Развитие устойчивости к ингибиторам ДГФР является серьёзной проблемой в клинической практике. Механизмы резистентности включают:

• Мутации в гене ДГФР, снижающие сродство к ингибитору (например, мутация в кодоне 108 у Plasmodium falciparum).
• Амплификация гена ДГФР, приводящая к увеличению количества фермента в клетке.
• Изменение транспортных систем, снижающее поступление ингибитора в клетку (например, снижение экспрессии фолатного транспортера RFC1).
• Активация альтернативных путей метаболизма фолатов (например, через тимидилатсинтазу, устойчивую к ингибиторам).

В бактериальной и паразитарной резистентности мутации в активном центре ДГФР (например, замена лейцина на аргинин в положении 22 у Escherichia coli) приводят к снижению эффективности триметоприма и пириметамина. Для преодоления резистентности разрабатываются ингибиторы нового поколения, такие как иклаприм и оксоплатин.

Применение в биотехнологии и исследованиях

ДГФР используется в качестве репортёрного гена в молекулярной биологии. Векторы, содержащие ген ДГФР, позволяют селекционировать клетки, экспрессирующие этот ген, с помощью метотрексата. Также фермент применяется в системах направленной эволюции белков для изучения механизмов катализа и устойчивости к лекарствам.

Интересные факты

• ДГФР является одним из наиболее изученных ферментов в структурной биологии: более 1000 кристаллических структур фермента из различных организмов депонированы в Protein Data Bank.
• В 1970-х годах было обнаружено, что некоторые бактерии (например, Lactobacillus casei) имеют ДГФР, устойчивую к триметоприму, что позволило изучать механизмы резистентности.
• Метотрексат, ингибирующий ДГФР, был одним из первых препаратов, показавших эффективность при лечении ревматоидного артрита, и до сих пор остаётся «золотым стандартом» терапии этого заболевания.

Источники

• Hitchings G.H., Elion G.B. The role of antimetabolites in the chemotherapy of neoplastic diseases. Cancer Research, 1958.
• Blakley R.L. The Biochemistry of Folic Acid and Related Pteridines. North-Holland Publishing Company, 1969.
• Schweitzer B.I., Dicker A.P., Bertino J.R. Dihydrofolate reductase as a therapeutic target. FASEB Journal, 1990.
• Kraut J., Matthews D.A. Dihydrofolate reductase: structure and function. Advances in Protein Chemistry, 1987.
• Berman H.M., Westbrook J., Feng Z. et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 2000.
• Gangjee A., Jain H.D., Kurup S. Recent advances in the design and synthesis of dihydrofolate reductase inhibitors. Current Medicinal Chemistry, 2007.