Флуоресцентная гибридизация in situ

Флуоресцентная гибридизация in situ (англ. fluorescence in situ hybridization, FISH) — это цитогенетический метод, позволяющий выявлять и определять положение специфических последовательностей ДНК или РНК на хромосомах, в ядрах клеток или на тканевых срезах с помощью флуоресцентно меченных зондов. Метод основан на способности одноцепочечных нуклеиновых кислот образовывать комплементарные пары (гибридизоваться) с целевыми последовательностями в фиксированном биологическом материале, после чего связанные зонды визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. FISH широко применяется в молекулярной биологии, медицинской генетике, онкологии и диагностике инфекционных заболеваний.

История

Метод гибридизации in situ был разработан в 1969 году независимо Джозефом Галлом и Мэри-Лу Пардью, которые использовали радиоактивно меченные зонды для выявления рибосомной РНК в ядрах клеток. Однако радиоактивные метки имели ряд недостатков: низкое разрешение, длительное время экспозиции и опасность для здоровья. В 1977 году была предложена альтернатива с использованием флуоресцентных красителей, а в 1980-х годах, благодаря развитию методов синтеза олигонуклеотидов и конъюгации флуорофоров, флуоресцентная гибридизация in situ стала практичным инструментом. Ключевой вклад в популяризацию FISH внесли работы Питера Лихтера и Дэвида Уорда в 1988 году, которые разработали протоколы для детекции хромосомных аномалий с помощью флуоресцентных зондов. С тех пор метод постоянно совершенствовался: появились многоканальные системы, позволяющие одновременно анализировать до 24 различных последовательностей (спектральное кариотипирование), а также автоматизированные системы анализа изображений.

Принцип метода

Основой FISH является гибридизация — процесс образования двуцепочечных молекул между одноцепочечным зондом и комплементарной последовательностью в образце. Процедура включает несколько этапов:

1. Фиксация и подготовка образца. Клетки или ткани фиксируются (обычно метанолом и уксусной кислотой или формальдегидом) для сохранения структуры нуклеиновых кислот. Затем образец обрабатывается протеазами для удаления белков, а ДНК денатурируется (нагреванием или химическими реагентами) для перевода в одноцепочечное состояние.

1. Приготовление зонда. Зонд — это фрагмент ДНК или РНК, комплементарный целевой последовательности. Он может быть получен методом клонирования, полимеразной цепной реакции (ПЦР) или химического синтеза. К зонду присоединяется флуоресцентный краситель (например, флуоресцеин, родамин, Cy3, Cy5) или комбинация красителей для создания уникальных спектральных сигналов.

1. Гибридизация. Зонд наносится на образец и инкубируется при определённой температуре (обычно 37–42 °C) в течение нескольких часов или ночи. В это время происходит связывание зонда с комплементарной последовательностью.

1. Отмывка. Несвязавшиеся зонды удаляются промывкой в буферных растворах разной строгости (контроль температуры и ионной силы), чтобы минимизировать неспецифическое связывание.

1. Детекция. Образец анализируется с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащённого набором фильтров, соответствующих спектрам возбуждения и эмиссии используемых красителей. Сигнал от зонда визуализируется в виде ярких точек на фоне окрашенных ядер (обычно с помощью DAPI — 4',6-диамидино-2-фенилиндола, связывающегося с ДНК).

Виды и типы зондов

В зависимости от цели исследования используются различные типы зондов:

• Центромерные зонды — связываются с повторяющимися последовательностями в области центромеры хромосом. Позволяют подсчитывать количество копий хромосом (например, при трисомиях).
• Теломерные зонды — нацелены на теломерные участки хромосом, используются для выявления делеций или транслокаций.
• Локус-специфические зонды — комплементарны уникальным последовательностям в определённых генах или участках хромосом. Применяются для детекции хромосомных перестроек (например, транслокации BCR-ABL при хроническом миелоидном лейкозе).
• Paint-зонды (хромосомные краски) — представляют собой смесь фрагментов, комплементарных всей длине одной хромосомы. Позволяют окрашивать целые хромосомы в разные цвета, что используется для выявления сложных транслокаций.
• РНК-зонды — нацелены на мРНК или другие РНК-мишени, позволяют изучать экспрессию генов на уровне отдельных клеток.

Применение

Медицинская генетика и диагностика

FISH является стандартным методом для выявления хромосомных аномалий в пренатальной и постнатальной диагностике. С его помощью определяют:

• Анеуплоидии (например, трисомия 21 — синдром Дауна, трисомия 18 — синдром Эдвардса, трисомия 13 — синдром Патау) в образцах амниотической жидкости или ворсин хориона.
• Микроделеционные синдромы (например, делеция 22q11.2 при синдроме ДиДжорджи, делеция 15q11-q13 при синдроме Прадера-Вилли).
• Хромосомные транслокации (например, филадельфийская хромосома t(9;22) при хроническом миелоидном лейкозе).

Онкология

В онкологии FISH применяется для:

• Генетической классификации опухолей — выявление специфических перестроек (например, транслокация EWSR1 при саркоме Юинга, амплификация HER2/neu при раке молочной железы).
• Оценки прогноза — амплификация или делеция определённых генов (например, делеция 1p/19q при глиомах).
• Мониторинга минимальной остаточной болезни — детекция клеток с аномалиями после лечения.

Исследовательская работа

В научных исследованиях FISH используется для:

• Картирования генов на хромосомах.
• Изучения пространственной организации генома — например, анализ взаимодействия теломер и ядерной оболочки.
• Анализа экспрессии генов в тканях (в сочетании с иммунофлуоресценцией).
• Идентификации микроорганизмов в образцах окружающей среды или клинических материалах (например, выявление бактерий в биоплёнках).

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая чувствительность — позволяет детектировать одиночные копии генов.
• Специфичность — зонды могут быть сконструированы под уникальные последовательности.
• Возможность анализа на уровне отдельных клеток — метод сохраняет морфологию ткани.
• Быстрота — результаты могут быть получены в течение 1–2 дней.
• Мультиплексность — одновременное использование нескольких зондов с разными красителями.

Ограничения

• Зависимость от качества образца — фиксация и хранение могут влиять на сигнал.
• Необходимость знания целевой последовательности — для синтеза зонда требуется информация о геноме.
• Ограниченное разрешение — метод не позволяет различать последовательности ближе 1–2 мегабаз (для стандартных зондов).
• Автофлуоресценция — некоторые ткани (например, печень) дают высокий фоновый сигнал.
• Сложность количественного анализа — точное измерение интенсивности сигнала требует калибровки.

Сравнение с другими методами

FISH дополняет такие методы, как:

• Кариотипирование — классический анализ хромосом под микроскопом, но требует делящихся клеток и имеет низкое разрешение для мелких перестроек.
• ПЦР в реальном времени — позволяет количественно оценить копии генов, но не даёт информации о локализации в клетках.
• Секвенирование нового поколения (NGS) — даёт высокое разрешение, но требует сложной биоинформатической обработки и не показывает пространственное распределение.
• Иммунофлуоресценция — детектирует белки, а не нуклеиновые кислоты, и часто используется в комбинации с FISH для изучения корреляции между геномной и белковой экспрессией.

Современные модификации

Развитие метода привело к появлению нескольких модификаций:

• Мультиплексная FISH (M-FISH) — использование комбинаций из 5–7 флуорофоров для окрашивания каждой хромосомы в уникальный цвет, что позволяет анализировать все хромосомы одновременно.
• Спектральное кариотипирование (SKY) — вариант M-FISH, где спектральные характеристики каждого пикселя изображения анализируются с помощью интерферометра.
• Комбинированная FISH с иммунофлуоресценцией (IF-FISH) — одновременная детекция ДНК/РНК и белков.
• FISH на тканевых срезах (Tissue FISH) — адаптация метода для парафиновых блоков, используемая в патологоанатомической практике.
• FISH в проточной цитометрии — позволяет количественно оценивать гибридизацию в суспензии клеток.

Источники

• Лихтер П., Уорд Д. (1988) «Флуоресцентная гибридизация in situ: метод для анализа хромосомных аномалий». Nature Genetics.
• Галл Дж., Пардью М.-Л. (1969) «Гибридизация нуклеиновых кислот in situ: метод для локализации последовательностей в клетках». Proceedings of the National Academy of Sciences.
• Шпильманн Ф., Лихтер П. (2005) «FISH: практическое руководство». Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Розенфельд Х., Браун Т. (2010) «Молекулярная цитогенетика: от FISH до спектрального кариотипирования». Springer.
• Методические рекомендации Минздрава РФ по применению FISH в онкологии (2018).