Люминесцентный анализ

Люминесцентный анализ — это совокупность физико-химических методов исследования, основанных на наблюдении и измерении люминесценции (свечения) вещества, возникающей после поглощения им энергии возбуждения. Метод позволяет определять качественный и количественный состав вещества, изучать его структуру, физико-химические свойства и кинетику процессов, протекающих в нём, по характеристикам испускаемого света.

История

Первые наблюдения люминесценции относятся к XVII веку, когда были описаны «холодные» свечения некоторых минералов и растворов. Однако систематическое изучение явления началось в XIX веке. В 1852 году английский физик Джордж Стокс сформулировал правило, согласно которому длина волны испускаемого света (люминесценции) всегда больше длины волны возбуждающего света (правило Стокса). Это открытие заложило основу для понимания природы люминесценции.

В конце XIX — начале XX века были открыты различные виды люминесценции (фотолюминесценция, катодолюминесценция, хемилюминесценция), а также разработаны первые приборы для её наблюдения — флуороскопы и спектрофотометры. Значительный вклад в развитие теории и практики люминесцентного анализа внесли советские учёные: С. И. Вавилов, который изучал кинетику люминесценции и ввёл понятие квантового выхода, и В. Л. Левшин, разработавший основы спектроскопии люминесценции.

В середине XX века, с появлением высокочувствительных фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) и лазерных источников возбуждения, люминесцентный анализ стал одним из самых чувствительных и широко распространённых методов аналитической химии, биофизики и материаловедения. В СССР и России метод активно применялся в геологии, медицине, криминалистике и контроле качества продукции.

Физические основы

Люминесценция — это неравновесное излучение, избыточное над тепловым излучением тела при данной температуре. Для её возникновения необходимо перевести атомы или молекулы вещества в возбуждённое состояние, из которого они возвращаются в основное, испуская квант света.

Виды люминесценции по способу возбуждения

• Фотолюминесценция — возбуждение светом (ультрафиолетовым, видимым или инфракрасным). Наиболее распространённый вид.
• Электролюминесценция — возбуждение электрическим полем или током (используется в светодиодах).
• Катодолюминесценция — возбуждение пучком электронов (применяется в электронно-лучевых трубках).
• Хемилюминесценция — возбуждение за счёт энергии химической реакции (например, свечение белого фосфора).
• Биолюминесценция — частный случай хемилюминесценции, протекающей в живых организмах (светлячки, некоторые медузы).
• Радиолюминесценция — возбуждение ионизирующим излучением (рентгеновским, гамма-излучением, альфа- и бета-частицами).
• Триболюминесценция — возбуждение при трении или разрушении кристаллов.
• Сонолюминесценция — возбуждение при схлопывании пузырьков в жидкости под действием ультразвука.

Основные характеристики люминесценции

• Спектр люминесценции — зависимость интенсивности испускаемого света от длины волны (или частоты). Характеризует энергетические уровни молекулы.
• Спектр возбуждения — зависимость интенсивности люминесценции от длины волны возбуждающего света. Показывает, какие участки спектра наиболее эффективно вызывают свечение.
• Квантовый выход — отношение числа испущенных квантов к числу поглощённых. Характеризует эффективность процесса.
• Время жизни — среднее время, в течение которого молекула находится в возбуждённом состоянии. Различают флуоресценцию (время жизни 10⁻⁹–10⁻⁷ с) и фосфоресценцию (время жизни 10⁻⁶–10² с и более).
• Поляризация — степень ориентации электрического вектора излучаемого света, зависящая от ориентации молекул.

Классификация методов люминесцентного анализа

Люминесцентный анализ подразделяется на качественный и количественный.

Качественный анализ

Основан на идентификации вещества по его спектру люминесценции, спектру возбуждения, времени жизни и другим характеристикам. Каждый люминофор (вещество, способное люминесцировать) имеет уникальный «отпечаток» — набор спектральных линий или полос. Метод позволяет обнаруживать и идентифицировать микропримеси в сложных смесях, например, в нефти, минералах, биологических тканях.

Количественный анализ

Основан на зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминофора в образце. Для большинства веществ в области малых концентраций эта зависимость линейна (закон Бугера — Ламберта — Бера для люминесценции). Количественный анализ широко применяется для определения концентрации веществ в растворах, газах и твёрдых телах. Чувствительность метода может достигать 10⁻¹²–10⁻¹⁵ г/мл.

По типу регистрируемого сигнала

• Спектрофлуориметрия — регистрация спектров люминесценции и возбуждения.
• Флуориметрия — измерение интенсивности люминесценции при фиксированных длинах волн возбуждения и регистрации.
• Кинетическая флуориметрия — измерение времени жизни люминесценции.
• Поляризационная флуориметрия — измерение степени поляризации люминесценции для изучения вращательной подвижности молекул.
• Люминесцентная микроскопия — визуализация распределения люминофоров в микрообразцах (клетках, тканях, материалах).

Применение

Люминесцентный анализ нашёл применение в самых разных областях науки и техники.

В химии и аналитической химии

• Определение микроколичеств металлов, органических соединений, лекарственных веществ.
• Анализ состава нефти и нефтепродуктов (например, обнаружение полициклических ароматических углеводородов).
• Контроль качества воды и воздуха на содержание загрязнителей.
• Изучение кинетики химических реакций.

В биологии и медицине

• Иммунофлуоресцентный анализ — метод обнаружения антигенов и антител с помощью флуоресцентно меченных антител. Широко используется для диагностики инфекционных заболеваний (ВИЧ, гепатит, грипп) и аутоиммунных патологий.
• Флуоресцентная микроскопия — визуализация клеточных структур, органелл, белков и ДНК с помощью флуоресцентных красителей (флуорофоров). Метод позволяет изучать динамику внутриклеточных процессов.
• Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) — метод локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах с помощью флуоресцентных зондов. Используется в цитогенетике для диагностики хромосомных аномалий.
• Диагностика рака — некоторые опухоли обладают собственной люминесценцией (аутофлуоресценцией) или накапливают флуоресцентные препараты, что позволяет их выявлять при эндоскопии.
• Определение концентрации глюкозы, холестерина, гормонов в биологических жидкостях.

В геологии и минералогии

• Поиск и идентификация минералов (например, шеелит, флюорит, урановые минералы) по их характерному свечению в ультрафиолетовом свете.
• Оценка содержания органического вещества в горных породах (нефтематеринские породы).
• Поиск месторождений нефти и газа по люминесценции битумов.

В криминалистике

• Обнаружение следов биологических жидкостей (крови, спермы, слюны) на месте преступления.
• Выявление подделок документов, денежных купюр, ценных бумаг (по люминесценции специальных меток или красителей).
• Идентификация наркотических и взрывчатых веществ.

В материаловедении

• Контроль качества полупроводниковых материалов (кремний, арсенид галлия) по катодолюминесценции.
• Изучение дефектов в кристаллах и стеклах.
• Создание люминофоров для люминесцентных ламп, экранов, светодиодов и лазеров.

В пищевой промышленности

• Обнаружение прогорклых жиров и масел.
• Контроль свежести мяса и рыбы.
• Выявление фальсификации продуктов (например, добавление растительных масел в сливочное).

Преимущества и недостатки

Преимущества

• Высокая чувствительность — позволяет обнаруживать вещества в концентрациях до 10⁻¹⁵ г/мл.
• Высокая селективность — возможность идентификации веществ по их уникальным спектрам.
• Экспрессность — анализ часто занимает от нескольких секунд до нескольких минут.
• Неразрушающий характер — во многих случаях образец не разрушается в процессе анализа.
• Возможность анализа малых количеств вещества (микролитры, микрограммы).
• Широкий диапазон анализируемых веществ — от неорганических ионов до сложных биополимеров.

Недостатки

• Необходимость в специальном оборудовании — источники возбуждения (УФ-лампы, лазеры), монохроматоры, высокочувствительные детекторы (ФЭУ, ПЗС-матрицы).
• Влияние внешних факторов — температура, pH, растворитель, присутствие посторонних веществ (тушителей люминесценции) могут искажать результаты.
• Ограниченная применимость — не все вещества обладают люминесценцией. Для анализа нелюминесцирующих веществ требуется их предварительная обработка (дериватизация) с образованием люминофоров.
• Сложность интерпретации спектров для многокомпонентных смесей.

Интересные факты

• Явление люминесценции используется в быту: люминесцентные лампы, светодиоды, светящиеся краски и игрушки.
• Некоторые минералы, такие как флюорит, меняют цвет свечения в зависимости от примесей (например, примесь европия даёт красное свечение, а иттербия — зелёное).
• В криминалистике для обнаружения невидимых следов крови используют раствор люминола, который при контакте с гемоглобином даёт хемилюминесценцию.
• Метод флуоресцентной микроскопии позволил учёным впервые наблюдать движение отдельных молекул внутри живой клетки.
• В России и СССР люминесцентный анализ активно развивался в Институте физических проблем имени П. Л. Капицы РАН и в Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова.

Источники

1. Левшин В. Л. «Люминесценция и её применение». — М.: Наука, 1972.
2. Лакович Дж. «Основы флуоресцентной спектроскопии». — М.: Мир, 1986.
3. Паркер С. «Фотолюминесценция растворов». — М.: Мир, 1972.
4. Вавилов С. И. «Собрание сочинений. Том 2. Физическая оптика». — М.: Изд-во АН СССР, 1952.
5. Большая советская энциклопедия. Статья «Люминесцентный анализ». — М.: Советская энциклопедия, 1969–1978.
6. Химическая энциклопедия. Том 2. Статья «Люминесцентный анализ». — М.: Советская энциклопедия, 1990.