Некроптоз¶

Некроптоз — это программируемая форма некроза клетки, механизм гибели, который, в отличие от апоптоза, не требует активации каспаз и приводит к разрыву клеточной мембраны с выходом внутриклеточного содержимого во внеклеточное пространство, вызывая воспалительную реакцию. Некроптоз является одним из видов регулируемой гибели клеток (regulated cell death, RCD) и служит альтернативным путём уничтожения клеток в условиях, когда апоптоз заблокирован (например, при ингибировании каспаз или при вирусной инфекции). Термин был предложен в 2005 году группой исследователей под руководством Дж. Юаня (J. Yuan) для описания клеточной гибели, индуцированной фактором некроза опухоли (TNF), но протекающей по некротическому морфотипу.

¶История открытия

Долгое время некроз считался исключительно случайным, неконтролируемым процессом, вызванным физическим или химическим повреждением. Однако в конце 1990-х годов было обнаружено, что некоторые формы некроза могут быть индуцированы специфическими сигналами и подавлены генетическими или фармакологическими вмешательствами. В 2005 году Д. Дегтерев и его коллеги показали, что гибель клеток, вызванная TNF в присутствии ингибитора каспаз (z-VAD-fmk), имеет характерные черты некроза, но при этом является программируемой. Этот процесс был назван некроптозом. Ключевым открытием стало выявление роли протеинкиназы RIPK1 (receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1) и её гомолога RIPK3 в передаче сигнала на гибель. В 2009 году была идентифицирована псевдокиназа MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein) как конечный исполнитель некроптоза, что завершило формирование молекулярной модели этого пути.

¶Молекулярные механизмы

¶Рецепторы и инициация

Некроптоз может запускаться различными внеклеточными и внутриклеточными стимулами. Наиболее изученным является путь, активируемый через рецепторы смерти (death receptors), такие как TNFR1 (рецептор фактора некроза опухоли 1), Fas (CD95) и TRAIL-рецепторы. При связывании лиганда (например, TNF-α) с TNFR1 формируется комплекс I, который включает адаптерные белки TRADD, TRAF2, cIAP1/2 и RIPK1. В норме этот комплекс стимулирует выживание клетки или апоптоз. Однако при ингибировании каспазы-8 или при дефиците cIAP1/2 происходит формирование комплекса IIb (некросомы), в котором RIPK1 активирует RIPK3.

Другими триггерами некроптоза являются:

• Рецепторы интерферона (IFNAR) при активации интерферонами I типа.
• Рецепторы Toll-подобных рецепторов (TLR3, TLR4) при распознавании вирусной РНК или липополисахаридов.
• Вирусные инфекции (например, вирус простого герпеса, вирус мышиного цитомегаловируса).
• Определённые химиотерапевтические агенты (например, даунорубицин).

¶Сборка некросомы

Центральным событием некроптоза является образование некросомы — цитоплазматического комплекса, состоящего из RIPK1, RIPK3 и MLKL. Активированная RIPK1 фосфорилирует RIPK3, что приводит к её олигомеризации. RIPK3, в свою очередь, фосфорилирует MLKL по ключевым остаткам (например, Thr357 и Ser358 у человека). Фосфорилированная MLKL меняет конформацию, олигомеризуется и транслоцируется к плазматической мембране.

¶Исполнение гибели

MLKL встраивается в липидный бислой мембраны, образуя поры или нарушая её целостность через взаимодействие с фосфатидилинозитолфосфатами. Это приводит к потере ионного гомеостаза, набуханию клетки и, в конечном итоге, к разрыву мембраны. Выход содержимого клетки, включая DAMPs (damage-associated molecular patterns), такие как HMGB1, АТФ, белки теплового шока и ураты, вызывает мощный воспалительный ответ, привлекая иммунные клетки.

¶Отличия от других форм гибели клеток

Некроптоз занимает промежуточное положение между апоптозом и классическим некрозом.

¶Физиологическая роль

¶Развитие и гомеостаз

Некроптоз играет роль в эмбриональном развитии, особенно в ремоделировании тканей и удалении клеток в условиях стресса. У мышей с нокаутом генов RIPK3 или MLKL наблюдаются нарушения в развитии лимфоидных органов и иммунной системы. В зрелом организме некроптоз участвует в обновлении эпителиальных клеток кишечника и кожи, а также в регуляции иммунного ответа.

¶Защита от инфекций

Некроптоз является важным механизмом врождённого иммунитета против внутриклеточных патогенов. Многие вирусы (например, вирус герпеса, вирус коровьей оспы) кодируют белки, ингибирующие апоптоз (например, вирусный ингибитор каспазы-8). В ответ клетка может активировать некроптоз, чтобы уничтожить заражённую клетку и высвободить DAMPs, привлекающие фагоциты и активирующие адаптивный иммунитет. Некоторые бактерии (например, Salmonella и Yersinia) также могут индуцировать некроптоз в макрофагах.

¶Патологическая роль

¶Воспалительные заболевания

Чрезмерный или неконтролируемый некроптоз связан с патогенезом многих воспалительных заболеваний. При системной воспалительной реакции (сепсисе) массивный некроптоз клеток эндотелия и паренхиматозных органов приводит к полиорганной недостаточности. При болезни Крона и язвенном колите мутации в генах, регулирующих некроптоз (например, ATG16L1), связаны с повышенной гибелью эпителиоцитов кишечника и хроническим воспалением. При панкреатите некроптоз ацинарных клеток поджелудочной железы является ключевым патогенетическим механизмом.

¶Нейродегенеративные заболевания

В центральной нервной системе некроптоз может быть вовлечён в гибель нейронов при ишемическом инсульте, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и боковом амиотрофическом склерозе (БАС). При ишемии мозга активация RIPK1 и RIPK3 в нейронах ведёт к их некротической гибели, что усугубляет неврологический дефицит. При БАС мутации в гене OPTN (оптиневрин) приводят к усилению некроптоза мотонейронов.

¶Онкология

Роль некроптоза в раке двойственна. С одной стороны, индукция некроптоза может уничтожать опухолевые клетки, особенно те, которые устойчивы к апоптозу. С другой стороны, некроптоз, сопровождающийся воспалением, может способствовать прогрессии опухоли, ангиогенезу и метастазированию. В некоторых типах рака (например, рак поджелудочной железы, меланома) наблюдается повышенная экспрессия RIPK3, что коррелирует с плохим прогнозом.

¶Фармакологическая регуляция

¶Ингибиторы некроптоза

Разработка ингибиторов некроптоза является активной областью исследований. Наиболее известным и широко используемым ингибитором является некростатин-1 (Nec-1), который блокирует активность RIPK1. Он был открыт в 2005 году и показал эффективность в моделях ишемии мозга, инфаркта миокарда и панкреатита. Однако Nec-1 имеет ограниченную селективность и стабильность. Более селективные ингибиторы RIPK1 (например, GSK'547, GSK'963) и RIPK3 (например, GSK'872, dabrafenib) проходят доклинические испытания. Ингибиторы MLKL (например, NSA-2, GW806742X) также находятся в разработке.

¶Индукторы некроптоза

Индукция некроптоза может быть терапевтически полезна для уничтожения опухолевых клеток, устойчивых к апоптозу. Комбинации химиотерапевтических агентов (например, даунорубицина) с ингибиторами каспаз (z-VAD-fmk) или с активаторами RIPK3 (например, SM-164) используются в экспериментальных протоколах. Однако клиническое применение ограничено из-за риска системного воспаления.

¶Методы детекции

Для обнаружения некроптоза в лабораторных условиях используются следующие методы:

• Микроскопия: световая микроскопия (набухание клеток, потеря мембраны), электронная микроскопия (разрушение органелл, вакуолизация).
• Биохимические методы: вестерн-блоттинг для выявления фосфорилированных форм RIPK1, RIPK3 и MLKL; иммунопреципитация для детекции некросомы.
• Флуоресцентные методы: окрашивание на проницаемость мембраны (пропидий йодид, SYTOX Green); использование антител к фосфо-MLKL.
• Функциональные тесты: измерение выхода лактатдегидрогеназы (LDH) в культуральную среду; оценка уровня АТФ.

¶Источники

• Degterev A, Huang Z, Boyce M, et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-119.
• Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-714.
• Sun L, Wang H, Wang Z, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-227.
• Weinlich R, Oberst A, Beere HM, Green DR. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(2):127-136.
• Pasparakis M, Vandenabeele P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 2015;517(7534):311-320.
• Newton K, Manning G. Necroptosis and Inflammation. Annu Rev Biochem. 2016;85:743-763.
• He S, Wang L, Miao L, et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 2009;137(6):1100-1111.