Ti-плазмида

Ti-плазмида (от англ. Tumor-inducing plasmid) — это внехромосомный генетический элемент, представляющий собой кольцевую молекулу ДНК, обнаруженную в клетках почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Ti-плазмида является ключевым фактором патогенности этого микроорганизма, вызывающего заболевание корончатый галл у двудольных растений. Уникальной особенностью Ti-плазмиды является её способность переносить часть своей ДНК (так называемую Т-ДНК) в геном растительной клетки, что делает её важнейшим инструментом генной инженерии растений.

История открытия

Изучение механизма образования корончатых галлов началось в начале XX века. В 1907 году американские учёные Эрвин Смит и Чарльз Таунсенд впервые установили, что заболевание вызывается бактерией, позднее названной Agrobacterium tumefaciens. Однако долгое время оставалось неясным, каким образом бактерия заставляет растительные клетки бесконтрольно делиться.

В 1940-х годах Армин Браун показал, что трансформированные клетки галла могут расти в культуре без добавления фитогормонов, что свидетельствовало о стабильном изменении их генома. В 1970-х годах группа исследователей под руководством Джеффа Шелла и Марка ван Монтегю (Бельгия) обнаружила, что вирулентность Agrobacterium связана с наличием крупной плазмиды. В 1977 году они доказали, что фрагмент этой плазмиды (Т-ДНК) интегрируется в ядерную ДНК растения. За это открытие Шелл и ван Монтегю были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине в 1998 году (совместно с Робертом Ферчготтом за открытия, связанные с оксидом азота). В 1983 году в лаборатории Монтегю и независимо в группе Мэри-Делл Чилтон (США) были созданы первые трансгенные растения с использованием Ti-плазмиды.

Структура и организация

Ti-плазмида представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК размером от 200 до 800 тысяч пар оснований (т. н. тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). В её структуре выделяют несколько функциональных регионов:

Т-ДНК (Transfer DNA)

Это участок плазмиды, который непосредственно переносится в растительную клетку. Размер Т-ДНК составляет от 10 до 30 т.п.н. Она фланкирована короткими повторяющимися последовательностями — левой (LB) и правой (RB) границами, которые являются сайтами узнавания для ферментов, осуществляющих перенос. Внутри Т-ДНК находятся гены, ответственные за синтез:

• Ауксинов и цитокининов — фитогормонов, вызывающих неконтролируемое деление клеток (образование галла).
• Опинов — специфических аминокислотных производных (например, нопалин, октопин), которые служат источником углерода и азота исключительно для бактерии Agrobacterium.

Reg-регион (Vir-регион)

Регион вирулентности (vir-гены) занимает около 40 т.п.н. и содержит набор генов, продукты которых обеспечивают процессинг и перенос Т-ДНК. Ключевые гены этого региона: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virH. Их экспрессия активируется фенольными соединениями (например, ацетосирингоном), выделяемыми повреждёнными тканями растений.

Регион репликации и конъюгации

Содержит гены, обеспечивающие автономную репликацию плазмиды в бактериальной клетке (oriV) и её способность к конъюгативному переносу между бактериями (tra-гены).

Регион катаболизма опинов

Включает гены, кодирующие ферменты для расщепления опинов, синтезируемых в галле. Это обеспечивает бактерии селективное преимущество в занимаемой экологической нише.

Механизм переноса Т-ДНК

Процесс переноса Т-ДНК из бактерии в растение включает несколько последовательных этапов:

1. Хемотаксис и прикрепление. Бактерия Agrobacterium распознаёт фенольные соединения, выделяемые из ранки растения, и прикрепляется к клеткам растения с помощью полисахаридов и белков адгезии.
2. Активация vir-генов. Фенольные соединения активируют двухкомпонентную систему VirA/VirG, которая запускает транскрипцию остальных vir-генов.
3. Процессинг Т-ДНК. Белок VirD2 (эндонуклеаза) разрезает одну из цепей ДНК в области правой границы (RB) и затем левой границы (LB). В результате образуется одноцепочечная молекула Т-ДНК (Т-цепь), к 5'-концу которой ковалентно присоединяется VirD2.
4. Транспорт через мембраны. Белки VirB образуют трансмембранный канал (тип IV секреторной системы), через который Т-цепь в комплексе с белками VirD2 и VirE2 (защищающим ДНК от нуклеаз) переносится в цитоплазму растительной клетки.
5. Ядерный импорт. Комплекс Т-ДНК с белками распознаётся растительными белками импорта и транспортируется в ядро.
6. Интеграция в геном. Т-ДНК встраивается в хромосомную ДНК растения, вероятно, с помощью механизмов репарации разрывов ДНК хозяина. Интеграция происходит случайным образом, но предпочтительно в транскрипционно активных регионах.

Типы Ti-плазмид

По типу опинов, синтезируемых в галле, Ti-плазмиды делят на несколько классов:

• Октопиновые — индуцируют синтез октопина.
• Нопалиновые — индуцируют синтез нопалина.
• Агропиновые — индуцируют синтез агропина.
• Миксоплазмиды — способны индуцировать синтез нескольких типов опинов.

Эти различия обусловлены вариабельностью генов в Т-ДНК, но не влияют на механизм переноса.

Применение в генной инженерии

Способность Ti-плазмиды переносить чужеродную ДНК в растения сделала её основой для создания генетически модифицированных (трансгенных) растений. Однако нативная Ti-плазмида непригодна для этой цели, так как её Т-ДНК содержит онкогены, вызывающие образование галлов. Поэтому в 1980-х годах были разработаны две основные стратегии модификации:

Бинарная векторная система

Наиболее распространённый подход. Он включает два компонента:

1. Бинарный вектор — небольшая плазмида, содержащая только левую и правую границы Т-ДНК, между которыми встраивается целевой ген (например, ген устойчивости к гербицидам или ген токсина против насекомых). Вектор также содержит селективный маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику) для отбора трансформированных клеток.
2. Хелперная Ti-плазмида — лишена Т-ДНК, но содержит полный набор vir-генов. Она обеспечивает перенос Т-ДНК из бинарного вектора в растение.

Коинтегративная система

В этом случае целевой ген встраивается непосредственно в Т-ДНК нативной Ti-плазмиды, после чего онкогены удаляются. Этот метод более трудоёмок и используется реже.

Процесс трансформации

1. В бинарный вектор клонируют целевой ген и селективный маркер.
2. Вектор вводят в клетки Agrobacterium tumefaciens.
3. Бактерией инфицируют фрагменты растения (например, диски листьев, семядоли).
4. Трансформированные растительные клетки отбирают на среде с селективным агентом (антибиотиком).
5. Из отобранных клеток регенерируют целое растение.

Преимущества и ограничения

Преимущества

• Высокая эффективность переноса ДНК.
• Возможность переноса крупных фрагментов ДНК (до 150 т.п.н.).
• Стабильная интеграция в геном растения.
• Относительная простота процедуры.

Ограничения

• Естественный хозяин Agrobacterium — преимущественно двудольные растения. Для однодольных (включая злаки, такие как пшеница, кукуруза, рис) эффективность трансформации ниже, хотя существуют специальные штаммы и методы (например, использование супервирулентных штаммов или обработка фенольными соединениями).
• Интеграция Т-ДНК происходит случайным образом, что может привести к нарушению работы собственных генов растения (эффект позиции).
• Необходимость регенерации целого растения из одной трансформированной клетки, что не всегда возможно для всех видов.

Интересные факты

• Agrobacterium tumefaciens называют «природным генным инженером», поскольку она единственный известный организм, способный естественным путём переносить ДНК между царствами (бактерии и растения).
• В 2015 году учёные из Японии и США показали, что Agrobacterium может переносить Т-ДНК не только в растения, но и в клетки дрожжей, грибов и даже человека (в культуре), хотя эффективность крайне низка.
• Первым трансгенным растением, созданным с помощью Ti-плазмиды, стал табак, устойчивый к антибиотику канамицину (1983 год).
• В 2019 году российские учёные из Института цитологии и генетики СО РАН разработали модифицированную Ti-плазмиду для эффективной трансформации пшеницы, что является важным шагом для отечественной селекции.

Источники

• Gelvin S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the «gene-jockeying» tool // Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 2003. — Vol. 67, № 1. — P. 16–37.
• Tzfira T., Citovsky V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology // Current Opinion in Biotechnology. — 2006. — Vol. 17, № 2. — P. 147–154.
• Lacroix B., Citovsky V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation // International Journal of Developmental Biology. — 2013. — Vol. 57, № 6-8. — P. 467–481.
• Pitzschke A., Hirt H. New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation // The EMBO Journal. — 2010. — Vol. 29, № 6. — P. 1021–1032.
• Белявский А. В., Гайворонская Л. М. Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens как вектор для генетической трансформации растений // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. — 2005. — № 4. — С. 3–10.