NASBA¶

NASBA (англ. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification — амплификация нуклеиновых кислот на основе последовательности) — это изотермический метод амплификации (увеличения количества) молекул РНК, используемый в молекулярной биологии и диагностике. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), NASBA не требует циклических изменений температуры и проводится при постоянной температуре, что делает его удобным для быстрой и высокочувствительной детекции РНК-содержащих патогенов, таких как вирусы (например, ВИЧ, вирус гепатита C, коронавирус SARS-CoV-2) и некоторые бактерии.

¶История

Метод NASBA был разработан в 1991 году группой исследователей под руководством Джонатана С. Х. К. (J. S. H. K. — точное имя не установлено) в компании Cangene (Канада) и впоследствии усовершенствован в лаборатории Университета Утрехта (Нидерланды). Первоначально метод назывался «амплификация РНК на основе транскрипции» (TMA — Transcription-Mediated Amplification), но позднее закрепилось название NASBA. В 1990-х годах NASBA активно применялся для диагностики вирусных инфекций, включая ВИЧ-1 и гепатит C, благодаря высокой чувствительности и специфичности. В 2000-х годах метод был адаптирован для детекции бактерий, грибов и паразитов, а также для количественного анализа экспрессии генов. В 2020-х годах NASBA стал одним из инструментов для быстрой диагностики COVID-19, особенно в условиях ограниченного доступа к ПЦР-оборудованию.

¶Принцип метода

NASBA основан на одновременном действии трёх ферментов: обратной транскриптазы, РНКазы H и РНК-полимеразы (обычно от бактериофага T7). Процесс амплификации происходит при постоянной температуре около 41 °C и включает следующие этапы:

1. Обратная транскрипция: РНК-мишень (например, вирусная РНК) связывается с праймером, содержащим промотор T7. Обратная транскриптаза синтезирует комплементарную цепь ДНК (кДНК).
2. Разрушение РНК: РНКаза H разрушает исходную РНК-цепь в образовавшемся гибриде РНК-ДНК.
3. Синтез второй цепи ДНК: Второй праймер связывается с кДНК, и обратная транскриптаза достраивает вторую цепь ДНК, формируя двуцепочечную ДНК с промотором T7.
4. Транскрипция: РНК-полимераза T7 распознаёт промотор и синтезирует множество копий РНК (до 10^6–10^9 копий за 1–2 часа).
5. Цикл амплификации: Каждая вновь синтезированная РНК-копия может служить матрицей для нового цикла обратной транскрипции и транскрипции, что приводит к экспоненциальному росту количества РНК.

В отличие от ПЦР, где амплификация ДНК требует циклического нагрева и охлаждения, NASBA не требует термоциклера, что упрощает оборудование и снижает время анализа.

¶Преимущества и недостатки

¶Преимущества

• Изотермичность: Не требует термоциклера, что снижает стоимость оборудования и энергопотребление.
• Высокая чувствительность: Обнаруживает до 10–100 копий РНК в образце.
• Специфичность: Использование праймеров с промотором T7 и ферментов, специфичных к РНК, исключает амплификацию ДНК-загрязнений.
• Быстрота: Анализ занимает 1–2 часа, что быстрее многих ПЦР-протоколов.
• Количественный анализ: Возможность оценки исходного количества РНК (например, вирусной нагрузки).

¶Недостатки

• Чувствительность к ингибиторам: Присутствие некоторых веществ (например, гемоглобина, гепарина) может подавлять реакцию.
• Сложность дизайна праймеров: Требуется тщательный подбор последовательностей для обеспечения специфичности.
• Ограниченная мультиплексность: Одновременная амплификация нескольких мишеней сложнее, чем в ПЦР.
• Необходимость контроля контаминации: Из-за высокой чувствительности возможны ложноположительные результаты при загрязнении образцов.

¶Применение

¶Диагностика инфекционных заболеваний

NASBA широко используется для выявления РНК-содержащих вирусов, таких как:

• ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека) — для количественного определения вирусной нагрузки.
• Вирус гепатита C (HCV) — для диагностики и мониторинга лечения.
• Вирус гепатита B (HBV) — хотя HBV содержит ДНК, метод может быть адаптирован для детекции РНК-транскриптов.
• Коронавирус SARS-CoV-2 — в 2020-х годах разработаны тест-системы на основе NASBA для быстрой диагностики COVID-19.
• Вирус гриппа A и B — для дифференциальной диагностики респираторных инфекций.
• Вирус Зика, лихорадки Денге, Эбола — для эпидемиологического мониторинга.

Также метод применяется для детекции бактерий (например, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae), грибов (Candida spp.) и паразитов (Plasmodium spp.).

¶Количественный анализ экспрессии генов

NASBA используется для измерения уровня мРНК в клетках и тканях, что важно для исследований генной экспрессии, в том числе в онкологии (например, для оценки экспрессии онкогенов) и фармакологии (для оценки эффективности лекарственных средств).

¶Пищевая микробиология и экология

Метод применяется для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах (например, Salmonella spp., Listeria monocytogenes) и в образцах окружающей среды (вода, почва).

¶Судебная медицина

NASBA может использоваться для идентификации биологических следов (например, крови, спермы) по РНК-маркерам.

¶Сравнение с другими методами амплификации

LAMP — петлевая изотермическая амплификация; TMA — амплификация на основе транскрипции (близкий аналог NASBA).

¶Коммерческие тест-системы

На основе NASBA разработаны несколько коммерческих диагностических наборов, в том числе:

• NucliSENS EasyQ (bioMérieux, Франция) — для количественного определения ВИЧ-1, HCV, HBV.
• NASBA-based kits для детекции SARS-CoV-2 (разработаны в 2020–2021 годах, в том числе в России — например, тест-система «АмплиТест» на основе NASBA, зарегистрированная в 2021 году).
• Real-time NASBA — модификация, позволяющая проводить количественный анализ в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов.

¶Ограничения и перспективы

Основным ограничением NASBA является необходимость строгого контроля температуры (41 °C ± 0,5 °C) и чувствительность к ингибиторам, что может ограничивать применение в полевых условиях. В то же время, метод активно совершенствуется: разрабатываются портативные устройства (например, на основе микрофлюидики), комбинированные подходы (NASBA с последующей детекцией с помощью CRISPR-Cas) и мультиплексные системы для одновременного выявления нескольких патогенов. В России NASBA используется в научных исследованиях и в некоторых диагностических лабораториях, но не является массовым методом из-за доминирования ПЦР.

¶Источники

1. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification // Nature. — 1991. — Vol. 350, № 6313. — P. 91–92.
2. Guatelli J. C. et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1990. — Vol. 87, № 5. — P. 1874–1878.
3. Deiman B. et al. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) // Molecular Biotechnology. — 2002. — Vol. 20, № 2. — P. 163–179.
4. Gill P., Ghaemi A. Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. — 2008. — Vol. 27, № 3. — P. 224–243.
5. Malek L. et al. Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) // Methods in Molecular Biology. — 1994. — Vol. 28. — P. 253–260.
6. Инструкция по применению тест-системы «АмплиТест SARS-CoV-2 NASBA» (Россия, 2021).