ПЦР-тест: метод диагностики¶
ПЦР-тест — лабораторный анализ, основанный на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР, англ. PCR — polymerase chain reaction), позволяющий обнаруживать в биологическом материале генетический материал (ДНК или РНК) конкретного возбудителя. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью: он способен выявить единичные копии генома вируса или бактерии задолго до того, как инфекция даст выраженные симптомы или станет определяемой другими тестами.
¶Принцип метода
ПЦР была разработана в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллис, за что в 1993 году он получил Нобелевскую премию по химии. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) определённого участка ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Реакция проходит в несколько циклов, каждый из которых состоит из трёх температурных этапов:
- Денатурация (94–98 °C) — разделение двойной спирали ДНК на две цепи.
- Отжиг праймеров (50–65 °C) — связывание коротких синтетических олигонуклеотидов (праймеров) с комплементарными участками целевой последовательности.
- Элонгация (72 °C) — синтез новой цепи ДНК полимеразой.
За 25–40 циклов количество копий целевого фрагмента возрастает экспоненциально — теоретически вдвое с каждым циклом. Накопленная ДНК становится обнаружимой с помощью флуоресцентных меток (реал-тайм ПЦР) или электрофореза.
¶Виды ПЦР-тестов
| Вид | Что выявляет | Применение |
|---|---|---|
| Качественный ПЦР-тест | Наличие/отсутствие ДНК или РНК возбудителя | Диагностика инфекций (ВИЧ, гепатиты B и C, COVID-19, хламидиоз) |
| Количественный ПЦР-тест (ПЦР real-time) | Концентрация генетического материала (вирусная нагрузка) | Мониторинг эффективности терапии, например при ВИЧ и гепатите C |
| ПЦР с генотипированием | Разновидность (генотип) возбудителя | Определение генотипа вируса гепатита C, выявление штаммов |
| Экспресс-ПЦР | Быстрое качественное определение | Скорая диагностика, например тесты на COVID-19 |
¶Материалы для исследования
В зависимости от предполагаемой инфекции забор материала проводится из разных локализаций:
- Мазок из носоглотки — для выявления респираторных вирусов (SARS-CoV-2, грипп).
- Кровь — для системных инфекций (ВИЧ, вирусные гепатиты).
- Моча — для урогенитальных инфекций (хламидиоз, гонорея, микоплазмоз).
- Сперма, секрет простаты — при подозрении на инфекции мужской репродуктивной системы.
- Соскоб из цервикального канала — для диагностики ВПЧ и других урогенитальных инфекций.
- Слюна — применяется в некоторых тест-системах.
¶ПЦР-тест при COVID-19
Во время пандемии COVID-19 ПЦР-тест стал «золотым стандартом» диагностики инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Метод обнаруживает РНК вируса в мазке из носоглотки. В России тестирование на коронавирус методом ПЦР было развёрнуто с февраля 2020 года; лаборатории Роспотребнадзора и частные клиники использовали отечественные тест-системы, разработанные, в частности, в Новосибирском центре «Вектор» и другими институтами.
К достоинствам ПЦР при COVID-19 относится высокая чувствительность — метод способен обнаружить вирус при низкой вирусной нагрузке, в том числе в инкубационном периоде. К ограничениям — длительность анализа (от 4–6 часов до суток), потребность в лабораторном оборудовании и обученном персонале, риск ложноположительных результатов при загрязнении материала.
¶Чувствительность и ограничения
Чувствительность ПЦР достигает 95–99 % при правильном заборе материала. Однако возможны ложноотрицательные результаты, если:
- материал собран с нарушением технологии (недостаточная глубина мазка, неправильное хранение);
- возбудитель локализован вне зоны забора;
- в материале присутствуют вещества, ингибирующие полимеразу.
Ложноположительные результаты чаще связаны с контаминацией лабораторного оборудования продуктами амплификации — настолько чувствителен метод, что даже единичные молекулы ДНК из предыдущего анализа могут дать сигнал.
¶Отличие от экспресс-тестов и ИФА
Альтернативой ПЦР являются экспресс-тесты на антигены (выявляют белки вируса, быстрее, но менее чувствительны) и метод ИФА (иммуноферментный анализ), обнаруживающий антитела к возбудителю. ИФА показывает иммунный ответ организма, который формируется через несколько дней после заражения, поэтому ИФА не подходит для ранней диагностики. ПЦР, напротив, выявляет сам возбудитель и применим в самые ранние сроки инфекции.
¶Применение помимо инфекционной диагностики
ПЦР-тестирование широко используется в других областях:
- Генетика — диагностика наследственных заболеваний, анализ полиморфизмов.
- Криминалистика — ДНК-экспертиза, идентификация личности.
- Отцовство — генетическая экспертиза родства.
- Ветеринария — диагностика болезней животных.
- Пищевая промышленность — контроль состава продуктов, выявление ГМО.
- Экология — анализ видового состава проб воды и почвы.
Источники:
- Маллис К. Цепная реакция. Изобретение, изменившее мир (Nobel Lecture, 1993)
- Справочник по лабораторной диагностике инфекционных болезней, под ред. В. И. Покровского
- Рекомендации Всемирной организации здравоохранения по лабораторной диагностике COVID-19
- Методические указания Роспотребнадзора по применению ПЦР-тест-систем