Кариотипирование — метод анализа хромосом¶
Кариотипирование — метод цитогенетического анализа, заключающийся в изучении набора хромосом соматической клетки организма (кариотипа) с определением их количества, морфологии и структуры. Метод позволяет выявить числовые аномалии (анеуплоидии), крупные структурные перестройки (делеции, дупликации, инверсии, транслокации), а также оценить половой хромосомный состав. Кариотипирование применяется в медицинской генетике, пренатальной диагностике, онкологии и селекции.
¶Основные понятия
Кариотип — совокупность хромосом клетки, представленная их формой, размером, положением центромеры и полосовым рисунком. В норме кариотип человека содержит 46 хромосом: 44 аутосомы и 2 половые (XX у женщин, XY у мужчин). Запись кариотипа выполняется по международной номенклатуре ISCN, например, 46,XX или 47,XX,+21 (болезнь Дауна).
¶Методика проведения
Классическое кариотипирование выполняется по следующему алгоритму:
- Получение материала. Наиболее часто используется периферическая венозная кровь, из которой выделяют лимфоциты. Другие источники — костный мозг, кожные фибробласты, амниотическая жидкость, ворсины хориона, опухолевая ткань.
- Культивирование. Клетки выращивают в питательной среде 48–72 часа. Для стимуляции митозов добавляют митоген — фитогемагглютинин. На поздних сроках культивирования вводят колхицин, блокирующий веретено деления в стадии метафазы.
- Гипотоническая обработка. Клетки обрабатывают гипотоническим раствором (обычно 0,075 М KCl), что вызывает набухание ядра и разрыхление хромосом.
- Фиксация и нанесение на стекло. Суспензию клеток фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1) и распределяют по предметным стёклам.
- Окрашивание. Для визуализации полосового (дискового) рисунка хромосомы окрашивают по методу Гимза (G-окрашивание) или по другим методикам: Q-окрашивание хинакрином, C-окрашивание гетерохроматина, Р-окрашивание плеч рибосомных генов, а также дифференциальное окрашивание теломерных и сателлитных участков.
- Анализ. Под микроскопом отбирают метафазные пластинки, фотографируют хромосомы, раскладывают их в пары и составляют идиограмму — схематическое изображение кариотипа.
¶Разновидности метода
¶Классическое (микроскопическое) кариотипирование
Позволяет выявлять аномалии хромосом крупного масштаба — геномные и хромосомные аберрации, изменение числа хромосом. Разрешающая способность метода составляет около 5–10 Мб (мегабаз). Метод не обнаруживает точечные мутации и малые делеции.
¶Высокое разрешение (high resolution)
Получение прометафазных и ранних профазных пластинок, когда хромосомы максимально вытянуты, позволяет увеличить число полос до 550–850 и более и повысить разрешение до 1–5 Мб.
¶Молекулярно-цитогенетические методы
Для диагностики микроделеций и микродупликаций разработаны методики с повышенной точностью:
- FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) — использование ДНК-зондов с флуоресцентной меткой для обнаружения конкретных последовательностей в хромосомах.
- МАФИШ (multiplex FISH) — одновременное использование множества зондов, окрашивающих каждую пару хромосом своим цветом.
- CGH (компаративная геномная гибридизация) — сравнение тестовой и нормальной ДНК для выявления зон потери или усиления сигнала.
- aCGH (микрочиповая CGH) — микрочип-based вариант, позволяющий обнаруживать аберрации размером от 50–100 кб.
¶Показания к проведению
Кариотипирование назначают при подозрении на хромосомные болезни и аномалии развития, при бесплодии и повторных самопроизвольных выкидышах, при подозрении на мозаицизм, при диагностике опухолей (особенно лейкемий, где выявляются характерные транслокации, например, филадельфийская хромосома t(9;22) при хроническом миелолейкозе). Обязательное кариотипирование проводится в рамках пренатальной диагностики при амниоцентезе и биопсии ворсин хориона, а также при ЭКО.
¶Кариотипирование в России
В Российской Федерации цитогенетическая диагностика проводится в медико-генетических центрах, крупнейшим из которых является Национальный медицинский исследовательский центр медицинской генетики (НМИЦ МГ, бывший ВНИИ медицинской генетики) в Новосибирске. Существует сеть региональных медико-генетических центров, обеспечивающих скрининг новорождённых и диагностику наследственных заболеваний.
¶Ограничения
Классическое кариотипирование не выявляет точечные мутации, небольшие инсерции и делеции, а также изменения в пределах полосы хромосомы. Для их обнаружения требуются молекулярно-генетические методы — ПЦР, секвенирование, а также молекулярно-цитогенетические подходы (FISH, aCGH). Кроме того, результат зависит от качества метафазных пластинок и квалификации цитогенетика.
¶Применение в селекции и ветеринарии
Кариотипирование используется для изучения хромосомных наборов сельскохозяйственных животных и растений, что позволяет устанавливать видовую принадлежность, выявлять гибридное происхождение и оценивать генетическое разнообразие популяций.
¶История
Первые кариотипы человека были получены в 1956 году, когда Тьо и Леван установили, что нормальное число хромосом человека равно 46. В 1960-е годы в Филадельфии была разработана международная система номенклатуры хромосомных болезней. Метод G-окрашивания, разработанный в начале 1970-х годов, позволил идентифицировать каждую пару хромосом по полосовому рисунку и стал основой современного кариотипирования.
¶Источники
- Гинцбург Е. Л., Гинбург В. Л. Цитогенетика человека. — М.: ГЭОТАР-Медиа.
- Медицинская генетика / под ред. И. Н. Захаровой, А. В. Филипова. — М.: ГЭОТАР-Медиа.
- Международная система номенклатуры хромосомных аберраций (ISCN).
- НМИЦ медицинской генетики — материалы по цитогенетической диагностике.