Трансгенные мыши¶

Трансгенные мыши — это лабораторные мыши (Mus musculus), в геном которых искусственно, методами генной инженерии, введены чужеродные гены (трансгены), или у которых изменены (нокаутированы) собственные гены. Трансгенные мыши являются одной из наиболее распространённых и важных модельных систем в биомедицинских исследованиях, позволяя изучать функции генов, механизмы развития заболеваний и тестировать новые лекарственные препараты.

¶История

Первые успешные эксперименты по созданию трансгенных мышей были проведены в начале 1980-х годов. В 1980 году американские учёные Джон Гордон и Фрэнк Раддл впервые продемонстрировали возможность введения чужеродной ДНК в геном мыши путём микроинъекции в пронуклеус оплодотворённой яйцеклетки. В 1982 году группа Ричарда Пальмитера и Ральфа Бринстера создала знаменитую «супермышь» (трансгенную мышь с геном гормона роста крысы), которая была значительно крупнее своих обычных сородичей. Этот эксперимент доказал, что встроенный ген может экспрессироваться и вызывать измеримые фенотипические изменения.

В 1989 году Марио Капекки, Мартин Эванс и Оливер Смитис разработали метод нокаута генов в эмбриональных стволовых клетках мыши, что позволило создавать мышей с целенаправленно выключенными определёнными генами. За эту работу они были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине в 2007 году. В последующие десятилетия технологии создания трансгенных мышей постоянно совершенствовались: появились методы условного нокаута (система Cre-loxP), индуцибельной экспрессии генов (тетрациклиновая система) и, наконец, редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9, которое значительно упростило и удешевило создание генетически модифицированных линий.

¶Методы создания

Существует несколько основных методов получения трансгенных мышей, которые различаются по сложности, эффективности и типу модификации.

¶Микроинъекция ДНК в пронуклеус

Это классический метод, используемый с 1980-х годов. Линейную ДНК, содержащую трансген, вводят с помощью тонкой стеклянной иглы в мужской пронуклеус оплодотворённой яйцеклетки. Затем яйцеклетку имплантируют в яйцевод псевдобеременной самки-реципиента. ДНК случайным образом встраивается в геном мыши, часто в виде тандемных повторов. Эффективность метода невысока (около 10–20% родившихся мышей содержат трансген), но он позволяет вводить гены любого размера (до нескольких сотен тысяч пар оснований).

¶Использование эмбриональных стволовых клеток

Этот метод применяется для создания нокаутных и нокаутных мышей. В эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши вводят модифицированную ДНК (вектор), содержащую ген, который должен быть заменён или выключен, а также селективный маркер (например, ген устойчивости к антибиотику). В ЭСК происходит гомологичная рекомбинация — замещение целевого гена на модифицированную копию. Затем отобранные клетки вводят в бластоцисту (ранний эмбрион), которую имплантируют самке. Рождаются химерные мыши, часть клеток которых происходит от модифицированных ЭСК. После скрещивания химер с обычными мышами получают линию с заданной мутацией.

¶Редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9

Система CRISPR/Cas9, адаптированная для работы с эукариотами в 2012–2013 годах, произвела революцию в создании трансгенных мышей. Метод основан на использовании направляющей РНК (sgRNA), которая доставляет нуклеазу Cas9 к определённому участку генома. Cas9 вносит двухцепочечный разрыв в ДНК, который затем репарируется клеткой. При репарации можно вставить чужеродную ДНК (трансген) или удалить/изменить небольшой фрагмент гена. CRISPR/Cas9 позволяет создавать трансгенных мышей непосредственно в зиготе, минуя стадию ЭСК, что делает процесс значительно более быстрым и дешёвым. Метод подходит для создания как простых нокаутов, так и более сложных модификаций (например, вставок репортёрных генов).

¶Типы генетических модификаций

Трансгенных мышей можно классифицировать по типу внесённых изменений.

• Трансгенные мыши (с добавлением гена): В геном встраивается дополнительный ген (трансген), который может быть как мышиным, так и чужеродным (например, человеческим). Трансген экспрессируется под контролем определённого промотора, что позволяет изучать его функцию в разных тканях или на разных стадиях развития.
• Нокаутные мыши (knockout): Определённый ген мыши полностью выключается (нокаутируется). Это позволяет изучать, какую функцию выполняет этот ген в норме. Если ген необходим для выживания, нокаут может быть летальным на эмбриональной стадии.
• Нокаутные мыши (knock-in): В геном встраивается модифицированная версия гена (например, с точечной мутацией, характерной для наследственного заболевания человека) или репортёрный ген (например, GFP — зелёный флуоресцентный белок), который позволяет визуализировать экспрессию целевого гена.
• Условные нокауты (conditional knockout): Ген выключается не во всём организме, а только в определённых тканях или на определённом этапе развития. Это достигается с помощью системы Cre-loxP: ген фланкируется сайтами loxP, а рекомбиназа Cre экспрессируется под контролем тканеспецифичного или индуцибельного промотора. Такой подход позволяет избежать летальности и изучать роль гена в конкретном органе.

¶Применение в науке и медицине

Трансгенные мыши являются незаменимым инструментом в фундаментальной и прикладной биологии.

¶Моделирование заболеваний человека

Трансгенные мыши используются для создания моделей многих наследственных и приобретённых заболеваний человека, включая рак, нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона), диабет, ожирение, сердечно-сосудистые заболевания, иммунодефициты и инфекционные болезни. В геном мыши вводят мутантные версии человеческих генов, вызывающие эти заболевания, или выключают гены, защищающие от них. Например, мыши с мутацией в гене BRCA1 используются для изучения рака молочной железы, а мыши с мутацией в гене APP — для моделирования болезни Альцгеймера.

¶Изучение функций генов

Нокаутные и нокаутные мыши позволяют систематически изучать функции тысяч генов. Сравнивая фенотип (внешние и внутренние характеристики) трансгенной мыши с нормальной, можно определить, за что отвечает конкретный ген. Проекты, такие как Международный консорциум нокаутных мышей (IKMC), ставят целью создать нокаутные линии для всех генов млекопитающих.

¶Доклинические испытания лекарств

Трансгенные мыши используются для тестирования эффективности и безопасности новых лекарственных препаратов. Например, мышей с перевитыми человеческими опухолями (ксенографты) или с генетическими моделями рака используют для оценки противоопухолевой активности соединений. Мыши с мутациями в генах, связанных с метаболизмом, применяются для тестирования препаратов от диабета и ожирения.

¶Изучение развития и физиологии

Трансгенные мыши с репортёрными генами (например, GFP) позволяют визуализировать экспрессию генов в живом организме, отслеживать миграцию клеток во время эмбрионального развития, изучать процессы дифференцировки и регенерации тканей.

¶Этические и правовые аспекты

Создание и использование трансгенных мышей регулируется национальными и международными нормами, направленными на обеспечение благополучия животных. В России действуют «Правила лабораторной практики» (GLP) и «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», которые регламентируют условия содержания, кормления и проведения экспериментов на животных. Любые исследования, предполагающие болезненные процедуры или страдания животных, должны быть одобрены этическим комитетом учреждения. Существуют принципы «3R» (Replacement, Reduction, Refinement — Замена, Сокращение, Усовершенствование), направленные на минимизацию использования животных и снижение их страданий. Генетическая модификация мышей не является объектом специального регулирования, отличного от общего регулирования биомедицинских исследований, за исключением случаев, когда речь идёт о создании линий, потенциально опасных для человека или окружающей среды (например, мышей, несущих гены возбудителей особо опасных инфекций).

¶Интересные факты

• Первая трансгенная мышь, получившая название «Супермышь», весила почти вдвое больше своих однопомётников из-за экспрессии гена гормона роста крысы.
• Мыши с нокаутом гена p53 (супрессора опухолей) являются одной из наиболее часто используемых моделей для изучения рака; они спонтанно развивают множественные опухоли в раннем возрасте.
• Трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий ген аполипопротеина E4 (APOE4), используются для моделирования болезни Альцгеймера, так как этот аллель является главным генетическим фактором риска поздней формы заболевания.
• С помощью системы CRISPR/Cas9 можно создавать мышей с несколькими модификациями одновременно (мультиплексное редактирование).