Грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные бактерии — это большая группа бактерий, которые не окрашиваются кристаллическим фиолетовым в ходе окрашивания по Граму и приобретают розовый или красный цвет после дополнительного окрашивания фуксином или сафранином. Данное свойство определяется особенностями строения их клеточной стенки, которая содержит тонкий слой пептидогликана и внешнюю мембрану, состоящую из липополисахаридов, фосфолипидов и белков. Грамотрицательные бактерии противопоставляются грамположительным бактериям, у которых толстый слой пептидогликана задерживает кристаллический фиолетовый, окрашивая клетки в сине-фиолетовый цвет. Данная классификация имеет фундаментальное значение для микробиологии, медицины и экологии, поскольку грамотрицательные бактерии включают множество патогенных для человека, животных и растений видов, а также играют ключевую роль в биогеохимических циклах.

История открытия и развития метода

Метод окрашивания по Граму был разработан датским бактериологом Хансом Кристианом Грамом в 1884 году. Первоначально метод предназначался для дифференциации бактерий в тканях лёгких пациентов, умерших от пневмонии. Грам обнаружил, что одни бактерии (позднее названные грамположительными) прочно удерживают краситель, в то время как другие (грамотрицательные) его теряют. В 1884 году Грам опубликовал работу «Ueber die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten», где впервые описал методику. Однако физико-химическое объяснение различий в окрашивании было дано значительно позже, в середине XX века, после открытия структуры клеточной стенки бактерий с помощью электронной микроскопии.

Строение клеточной стенки

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет сложную многослойную структуру, которая принципиально отличается от таковой у грамположительных бактерий.

Пептидогликановый слой

Внутренний слой клеточной стенки состоит из пептидогликана (муреина). У грамотрицательных бактерий этот слой значительно тоньше (толщиной от 2 до 7 нанометров), чем у грамположительных (20–80 нанометров). Пептидогликан состоит из параллельных цепочек N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, сшитых пептидными мостиками. Тонкий слой пептидогликана не способен удерживать кристаллический фиолетовый после обработки спиртом или ацетоном, что и приводит к обесцвечиванию клеток на этапе окрашивания по Граму.

Внешняя мембрана

Наружный слой представлен внешней мембраной, которая является уникальной особенностью грамотрицательных бактерий. Внешняя мембрана представляет собой асимметричный бислой липидов:

• Внутренний листок состоит из фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин и др.).
• Внешний листок содержит в основном липополисахариды (ЛПС). ЛПС состоит из трёх компонентов: липида А (якорная часть, встроенная в мембрану), корового олигосахарида и О-специфической полисахаридной цепи (О-антигена). Липид А является основным компонентом, ответственным за токсические свойства грамотрицательных бактерий (эндотоксин).

Внешняя мембрана выполняет барьерную функцию, защищая клетку от действия многих антибиотиков, жёлчных кислот, лизоцима и других агрессивных веществ. Однако она проницаема для небольших гидрофильных молекул через поры, образованные белками-поринами.

Периплазматическое пространство

Между цитоплазматической мембраной и внешней мембраной находится периплазматическое пространство — гелеобразная область, содержащая слой пептидогликана. В этом пространстве находятся различные ферменты (например, гидролазы, связывающие белки, ферменты биосинтеза пептидогликана), а также белки, участвующие в транспорте веществ.

Классификация и основные группы

Грамотрицательные бактерии включают огромное разнообразие видов, относящихся к различным таксонам. Большинство известных бактерий являются грамотрицательными. Ключевыми филумами (типами) грамотрицательных бактерий являются:

• Proteobacteria — крупнейший и наиболее разнообразный тип, включающий множество патогенов (Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Rickettsia) и симбионтов (Rhizobium, Azotobacter). Делятся на пять классов: Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- и Epsilonproteobacteria.
• Bacteroidetes — включают Bacteroides (обитатели кишечника человека), Flavobacterium, а также патогенов, вызывающих пародонтит (Porphyromonas gingivalis).
• Cyanobacteria (сине-зелёные водоросли) — фотосинтезирующие бактерии, осуществляющие кислородный фотосинтез. Имеют грамотрицательное строение клеточной стенки.
• Chlamydiae — облигатные внутриклеточные паразиты, вызывающие хламидиоз, трахому и другие заболевания. Отличаются уникальным жизненным циклом с чередованием элементарных и ретикулярных телец.
• Spirochaetes — спиралевидные бактерии, включающие Treponema pallidum (сифилис), Borrelia burgdorferi (болезнь Лайма) и Leptospira interrogans (лептоспироз).
• Deinococcus-Thermus — устойчивые к радиации и высоким температурам бактерии, например, Deinococcus radiodurans.

Физиологические и экологические особенности

Грамотрицательные бактерии демонстрируют огромное разнообразие метаболических путей. Среди них встречаются:

• Аэробы (Neisseria, Pseudomonas).
• Факультативные анаэробы (Escherichia coli, Salmonella).
• Облигатные анаэробы (Bacteroides, Fusobacterium).
• Хемоавтотрофы (Nitrosomonas, Nitrobacter — окисляют аммиак и нитриты).
• Фототрофы (Cyanobacteria, пурпурные и зелёные серные бактерии).

Экологически грамотрицательные бактерии распространены повсеместно: в почве, воде, воздухе, в организмах растений, животных и человека. Они участвуют в круговороте углерода, азота, серы и фосфора. Например, цианобактерии являются одними из главных продуцентов кислорода на Земле, а ризобии вступают в симбиоз с бобовыми растениями, фиксируя атмосферный азот.

Патогенность и медицинское значение

Грамотрицательные бактерии являются возбудителями широкого спектра инфекционных заболеваний человека и животных. К числу наиболее значимых патогенов относятся:

• Escherichia coli — вызывает кишечные инфекции (диарею, геморрагический колит), инфекции мочевыводящих путей, менингит у новорождённых, сепсис.
• Salmonella enterica — возбудитель брюшного тифа и сальмонеллёза.
• Shigella dysenteriae — возбудитель дизентерии.
• Neisseria meningitidis — возбудитель менингококковой инфекции (менингит, менингококкцемия).
• Neisseria gonorrhoeae — возбудитель гонореи.
• Pseudomonas aeruginosa — оппортунистический патоген, вызывающий инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, ожоговые инфекции, инфекции дыхательных путей при муковисцидозе.
• Yersinia pestis — возбудитель чумы.
• Vibrio cholerae — возбудитель холеры.
• Helicobacter pylori — возбудитель гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциирован с раком желудка.
• Rickettsia rickettsii — возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор.
• Bordetella pertussis — возбудитель коклюша.
• Legionella pneumophila — возбудитель легионеллёза («болезни легионеров»).

Патогенетические механизмы

Патогенность грамотрицательных бактерий связана с несколькими факторами:

1. Эндотоксин (липополисахарид, ЛПС) . Липид А ЛПС, высвобождающийся при разрушении бактериальной клетки, является мощным пирогеном и активатором иммунной системы. Он связывается с рецепторами TLR4 на макрофагах и дендритных клетках, запуская каскад воспалительных реакций. Массивное высвобождение ЛПС может привести к эндотоксическому шоку (септическому шоку), который является жизнеугрожающим состоянием с высокой летальностью.

1. Адгезины — белки на поверхности бактерий, обеспечивающие прикрепление к клеткам хозяина (например, пили у Neisseria gonorrhoeae).

1. Инвазины — белки, способствующие проникновению бактерий внутрь клеток хозяина (например, у Shigella и Salmonella).

1. Токсины — белки, выделяемые бактериями и повреждающие клетки хозяина. Например, холерный токсин Vibrio cholerae вызывает массивную секрецию воды и электролитов в просвет кишечника.

1. Капсула — полисахаридная оболочка, защищающая бактерии от фагоцитоза (например, у Neisseria meningitidis).

Антибиотикорезистентность

Грамотрицательные бактерии представляют серьёзную проблему для здравоохранения из-за широко распространённой устойчивости к антибиотикам. Внешняя мембрана сама по себе является барьером для многих антибиотиков (например, ванкомицина, пенициллина G). Кроме того, у грамотрицательных бактерий развились многочисленные механизмы резистентности:

• Продукция β-лактамаз — ферментов, разрушающих β-лактамные антибиотики (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы). Особую опасность представляют β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) и карбапенемазы (например, KPC, NDM-1).
• Изменение поринов — мутации в белках-поринах внешней мембраны снижают проницаемость для антибиотиков.
• Эффлюксные насосы — активный выброс антибиотиков из клетки (например, система MexAB-OprM у Pseudomonas aeruginosa).
• Модификация мишени — изменение структуры белков-мишеней антибиотиков (например, ДНК-гиразы для фторхинолонов).

Особую тревогу вызывает рост числа инфекций, вызванных мультирезистентными (MDR) и панрезистентными (PDR) штаммами грамотрицательных бактерий, таких как Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae, продуцирующие карбапенемазы. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила эти бактерии в список приоритетных патогенов для разработки новых антибиотиков.

Значение в биотехнологии и промышленности

Грамотрицательные бактерии широко используются в биотехнологии и промышленности:

• Escherichia coli — модельный организм и основной хозяин для продукции рекомбинантных белков (инсулин, гормоны роста, ферменты). Разработаны многочисленные штаммы E. coli, оптимизированные для экспрессии гетерологичных генов.
• Pseudomonas putida — используется для биоремедиации (разложения нефти, ксенобиотиков) и синтеза полигидроксиалканоатов (биопластиков).
• Synechocystis и другие цианобактерии — используются для производства биотоплива (биоводорода, этанола) и в фотосинтетических биореакторах.
• Agrobacterium tumefaciens — используется в генной инженерии растений для переноса чужеродных генов (метод агробактериальной трансформации).
• Rhizobium — используется в сельском хозяйстве для инокуляции бобовых культур с целью повышения фиксации азота.

Источники

• Грам, Х. К. (1884). Ueber die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. Fortschritte der Medicin, 2, 185–189.
• Мюррей, П. Р., Розенталь, К. С., Пфаллер, М. А. (2016). Медицинская микробиология. 8-е издание. Elsevier.
• Мадган, М. Т., Мартинко, Дж. М., Сталь, Д. А., Кларк, Д. П. (2015). Микробиология Брока. 14-е издание. Pearson.
• Всемирная организация здравоохранения (2017). Приоритетный список патогенов ВОЗ для разработки новых антибиотиков.
• Никитин, Д. А., & Козлов, Р. С. (2020). Антибиотикорезистентность грамотрицательных бактерий: современное состояние проблемы. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 22(1), 4–15.
• Сильхави, Т. Дж., Кахне, Д., Уокер, С. (2010). Бактериальная клеточная стенка: структура и функции. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2(5), a000414.