Циркулирующая опухолевая ДНК

Циркулирующая опухолевая ДНК (цоДНК, англ. circulating tumor DNA, ctDNA) — это фрагменты внеклеточной ДНК, которые попадают в системный кровоток в результате апоптоза, некроза или активной секреции клетками злокачественных новообразований. Является компонентом общей циркулирующей свободной ДНК (внеклеточной ДНК, вкДНК), которая присутствует в плазме крови здоровых людей, но при онкологических заболеваниях её доля может возрастать. цоДНК несёт генетические и эпигенетические изменения, характерные для опухоли (мутации, делеции, амплификации, метилирование), что делает её перспективным биомаркером для неинвазивной диагностики, мониторинга и прогноза рака (так называемая «жидкая биопсия»).

История открытия и изучения

Феномен внеклеточной ДНК в крови был впервые описан в 1948 году французскими учёными Манделем и Метаисом, однако его связь с опухолевым процессом была установлена значительно позже. В 1977 году Леон и соавторы обнаружили повышенные уровни свободной ДНК в сыворотке пациентов с онкологическими заболеваниями. В 1994 году, с развитием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), было показано, что часть этой ДНК имеет мутации, идентичные мутациям в опухолевой ткани (например, в гене KRAS при колоректальном раке). Ключевым прорывом стало внедрение в 2000-х годах методов высокопроизводительного секвенирования (NGS) и цифровой капельной ПЦР (ddPCR), которые позволили детектировать цоДНК с высокой чувствительностью, даже при её низкой концентрации (менее 0,01% от общей вкДНК). В 2010-х годах начались первые клинические исследования по применению жидкой биопсии для мониторинга ответа на терапию и выявления резистентных мутаций. В 2016 году Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA) одобрило первый тест на основе цоДНК (cobas EGFR Mutation Test v2) для выбора таргетной терапии немелкоклеточного рака лёгкого.

Механизмы высвобождения и биологические свойства

Происхождение фрагментов

Основными источниками цоДНК в крови являются:

• Апоптоз опухолевых клеток — наиболее частый механизм. При апоптозе ДНК фрагментируется эндонуклеазами на строго определённые фрагменты длиной около 166–200 пар оснований (п.о.), что соответствует длине ДНК, обёрнутой вокруг нуклеосомы.
• Некроз — при быстром росте опухоли или гипоксии клетки разрушаются, высвобождая более крупные фрагменты (до 1000 п.о. и более).
• Активная секреция — некоторые опухолевые клетки способны выделять внеклеточные везикулы (экзосомы), содержащие ДНК.
• Микронуклеусы — фрагменты ДНК, образующиеся при неправильном делении клеток.

Факторы, влияющие на концентрацию

Уровень цоДНК в плазме крови зависит от:

• Стадии и типа опухоли: при метастатическом раке концентрация цоДНК обычно выше, чем при локализованном. Наиболее высокие уровни наблюдаются при раке лёгкого, колоректальном раке, раке яичников и меланоме; при глиомах и раке предстательной железы — значительно ниже.
• Объёма опухолевой массы: корреляция между размером опухоли и количеством цоДНК не всегда прямая, но в целом более агрессивные и пролиферирующие опухоли дают больше фрагментов.
• Скорости клиренса: цоДНК быстро выводится из кровотока (период полувыведения составляет от 15 минут до 2 часов) в основном за счёт ферментативного расщепления в печени и почках. Это позволяет оценивать динамику опухоли в реальном времени.
• Сопутствующих состояний: воспаление, травмы, интенсивные физические нагрузки могут повышать общий уровень вкДНК, что снижает специфичность.

Отличие от геномной ДНК

В отличие от ядерной ДНК здоровых клеток, цоДНК:

• имеет меньший размер (преимущественно 150–200 п.о.);
• несёт соматические мутации, характерные для конкретной опухоли;
• часто содержит специфические паттерны метилирования;
• может быть фрагментирована в определённых сайтах (например, вблизи генов, активно транскрибируемых в опухоли).

Методы детекции и анализа

Выделение и подготовка образцов

Для анализа цоДНК используется плазма крови (реже сыворотка, ликвор, моча). Кровь собирают в пробирки с ЭДТА или специальные стабилизирующие пробирки (например, Cell-Free DNA BCT), которые предотвращают разрушение клеток и высвобождение геномной ДНК. Плазму отделяют центрифугированием в течение 1–2 часов после забора. Выделение цоДНК проводят с помощью коммерческих наборов (например, QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, Maxwell RSC ctDNA Kit), основанных на связывании нуклеиновых кислот с магнитными частицами или мембранами.

Основные методы анализа

• Цифровая капельная ПЦР (ddPCR) — позволяет количественно определять известные мутации с чувствительностью до 0,01%. Каждый образец разделяется на тысячи нанолитровых капель, в которых происходит независимая ПЦР-амплификация. Метод подходит для мониторинга единичных мутаций (например, EGFR T790M, KRAS G12C).
• Высокопроизводительное секвенирование (NGS) — позволяет одновременно анализировать сотни генов. Используются панели генов (например, Guardant360, FoundationOne Liquid) или секвенирование всего экзома/генома. NGS может выявлять мутации с низкой частотой аллелей (до 0,1–0,5%), но требует большего количества ДНК и более сложной биоинформатической обработки.
• Секвенирование метилирования — анализ паттернов метилирования CpG-островков в промоторах генов-супрессоров (например, SEPT9, MGMT) с помощью бисульфитной конверсии или ферментативного расщепления. Используется для ранней диагностики и определения тканевого происхождения опухоли.
• Анализ фрагментома — изучение размеров и концевых мотивов фрагментов цоДНК. Опухолевые фрагменты часто имеют более короткую длину и специфические концевые последовательности, что может быть использовано для дифференциации от нормальной вкДНК.

Ограничения методов

• Низкая концентрация цоДНК при ранних стадиях или после хирургического удаления опухоли.
• Контаминация геномной ДНК из разрушенных лейкоцитов (особенно при гемолизе).
• Высокая стоимость NGS и необходимость в специализированном оборудовании.
• Ложноположительные результаты из-за клонального гемопоэза неопределённого потенциала (CHIP) — мутаций в кроветворных клетках, которые могут быть ошибочно приняты за опухолевые.

Клиническое применение

Ранняя диагностика и скрининг

цоДНК позволяет выявлять рак на ранних стадиях, когда опухоль ещё не визуализируется инструментальными методами. Например, тест на метилирование гена SEPT9 в плазме используется для скрининга колоректального рака (одобрен FDA). Мультианалитные подходы (например, CancerSEEK, Galleri) комбинируют анализ мутаций и белковых маркеров для одновременного выявления нескольких типов рака. Однако чувствительность для ранних стадий (I–II) остаётся ограниченной (50–70% в зависимости от типа рака).

Мониторинг ответа на терапию

Одним из наиболее востребованных применений является отслеживание динамики цоДНК в процессе лечения. Снижение уровня цоДНК после начала химиотерапии или таргетной терапии коррелирует с положительным ответом, а повторное повышение может указывать на прогрессирование заболевания за 2–12 недель до клинических проявлений. Это позволяет своевременно корректировать лечение.

Выявление резистентных мутаций

При развитии устойчивости к таргетным препаратам (например, к ингибиторам EGFR при раке лёгкого) в цоДНК могут быть обнаружены новые мутации (например, EGFR T790M, C797S). Это даёт возможность перейти на препараты следующего поколения без повторной биопсии опухоли.

Оценка минимальной остаточной болезни (МОБ)

После радикального лечения (хирургия, лучевая терапия) наличие цоДНК в плазме через 2–4 недели указывает на высокий риск рецидива. Мониторинг МОБ с помощью цоДНК используется при колоректальном, раке молочной железы, мочевого пузыря и других локализациях.

Определение тканевого происхождения

Анализ метилирования и мутационного профиля цоДНК позволяет с высокой точностью (до 80–90%) определить, из какого органа происходит опухоль, что особенно важно при метастазах неизвестного первичного очага.

Преимущества и ограничения

Преимущества перед традиционной биопсией

• Неинвазивность — достаточно забора крови, что снижает риск осложнений и дискомфорт для пациента.
• Возможность многократного повторения — позволяет проводить динамическое наблюдение.
• Гетерогенность опухоли — цоДНК отражает генетический профиль всех метастатических очагов, а не только одного участка ткани, что снижает риск ошибки из-за внутриопухолевой гетерогенности.
• Применимость при недоступности опухоли — например, при раке лёгкого с центральным расположением или при метастазах в головной мозг.

Ограничения

• Низкая чувствительность при ранних стадиях и некоторых типах рака (например, рак предстательной железы, глиобластома).
• Необходимость в подтверждении — положительный результат цоДНК требует подтверждения тканевой биопсией для выбора терапии.
• Стандартизация — отсутствие единых протоколов выделения, анализа и интерпретации результатов между лабораториями.
• Стоимость — особенно для NGS-панелей и мультианалитных тестов.

Перспективы развития

Основные направления исследований включают:

• Повышение чувствительности за счёт использования более чувствительных методов (например, одномерная молекулярная ПЦР, секвенирование с ультраглубоким покрытием).
• Мультиомный подход — комбинация анализа цоДНК, цоРНК, белков, метаболитов и внеклеточных везикул для повышения точности диагностики.
• Скрининг населения — разработка недорогих тестов для массового обследования на рак (например, в рамках диспансеризации).
• Использование в других биологических жидкостях — цереброспинальной жидкости (для глиом), моче (для рака мочевого пузыря), слюне (для рака головы и шеи).
• Искусственный интеллект — для анализа паттернов фрагментации, метилирования и мутаций с целью прогнозирования клинических исходов.

Источники

1. Mandel P., Metais P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme // Comptes Rendus des Séances de la Société de Biologie et de ses Filiales. — 1948. — Vol. 142, № 3–4. — P. 241–243.
2. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M., Yaros M.J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy // Cancer Research. — 1977. — Vol. 37, № 3. — P. 646–650.
3. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A., et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics // Nature Medicine. — 2008. — Vol. 14, № 9. — P. 985–990.
4. Wan J.C.M., Massie C., Garcia-Corbacho J., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA // Nature Reviews Cancer. — 2017. — Vol. 17, № 4. — P. 223–238.
5. Siravegna G., Marsoni S., Siena S., Bardelli A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer // Nature Reviews Clinical Oncology. — 2017. — Vol. 14, № 9. — P. 531–548.
6. Oxnard G.R., Paweletz C.P., Kuang Y., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA // Clinical Cancer Research. — 2014. — Vol. 20, № 6. — P. 1698–1705.
7. Phallen J., Sausen M., Adleff V., et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA // Science Translational Medicine. — 2017. — Vol. 9, № 403. — P. eaan2415.
8. Cohen J.D., Li L., Wang Y., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test // Science. — 2018. — Vol. 359, № 6378. — P. 926–930.
9. Tie J., Wang Y., Tomasetti C., et al. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer // Science Translational Medicine. — 2016. — Vol. 8, № 346. — P. 346ra92.
10. Heitzer E., Haque I.S., Roberts C.E.S., Speicher M.R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology // Nature Reviews Genetics. — 2019. — Vol. 20, № 2. — P. 71–88.