ПЦР-диагностика: метод выявления ДНК и РНК возбудителей¶

ПЦР-диагностика — это лабораторный метод медицинской диагностики, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий обнаруживать генетический материал (ДНК или РНК) возбудителей заболеваний в исследуемом биологическом материале. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью: он способен выявить единичные копии генома патогена, в том числе на ранних стадиях инфекции, когда другие методы (например, серологические тесты) ещё не дают результата.

¶Принцип метода

ПЦР была разработана в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллис, за что он в 1993 году получил Нобелевскую премию по химии. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) определённого участка ДНК in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы и коротких олигонуклеотидных праймеров, комплементарных фланкирующим последовательностям целевого участка.

Процесс состоит из циклов, каждый из которых включает три стадии:

1. Денатурация — нагревание образца до 94–98 °C, при котором двуцепочечная ДНК разделяется на одноцепочечные матрицы.
2. Отжиг праймеров — охлаждение до 50–65 °C, при котором праймеры связываются с комплементарными участками матрицы.
3. Элонгация — синтез новой цепи ДНК полимеразой при 72 °C.

Каждый цикл удваивает количество копий целевой последовательности. За 30–40 циклов из единичной молекулы ДНК может образоваться миллиард копий, что делает продукт амплификации обнаружимым.

¶Виды ПЦР-диагностики

В клинической лабораторной практике используют несколько модификаций полимеразной цепной реакции:

¶Биологический материал

Для ПЦР-диагностики могут использоваться различные типы биологических материалов в зависимости от предполагаемой инфекции:

• кровь (в том числе венозная, из пальца, пуповинная);
• мазки со слизистых оболочек (носоглотка, уретра, цервикальный канал);
• моча;
• слюна;
• ликвор (спинномозговая жидкость);
• биоптаты тканей;
• мокрота;
• семенная жидкость.

¶Область применения

ПЦР-диагностика нашла широкое применение в различных областях медицины:

¶Инфекционные заболевания

Это основная область применения метода. ПЦР используется для выявления:

• вирусов — ВИЧ, вирусов гепатитов A, B, C, вируса герпеса, вируса папилломы человека (ВПЧ), вируса гриппа, возбудителя COVID-19 (SARS-CoV-2), вируса Эбола;
• бактерий — Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулёза), Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, боррелий (болезнь Лайма);
• простейших — Toxoplasma gondii, Plasmodium spp., Leishmania spp.;
• грибов — Candida spp., Aspergillus spp.

Особую ценность метод представляет для диагностики «скрытых» (латентных) инфекций и инфекций, передающихся половым путём, а также для обследования новорождённых (например, токсоплазмоз, цитомегаловирусная инфекция).

¶Онкология

ПЦР применяется для выявления онкогенных штаммов ВПЧ (16, 18 и другие типы), ассоциированных с раком шейки матки, а также для определения генетических маркеров некоторых опухолей.

¶Фармакогенетика и генетика

Метод используется для идентификации генов, определяющих индивидуальную чувствительность к лекарственным препаратам, диагностики наследственных заболеваний, а также в судебно-медицинской экспертизе для установления личности по ДНК (ДНК-профилирование).

¶Ветеринария и ветеринарно-санитарная экспертиза

ПЦР применяется для диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных и контроля продуктов питания на наличие возбудителей.

¶Преимущества и ограничения

Преимущества ПЦР-диагностики:

• высокая чувствительность — возможность обнаружения единичных копий генома;
• высокая специфичность — метод отличает родственные виды возбудителей;
• ранняя диагностика — выявление инфекции в инкубационном периоде или в первые дни заболевания;
• возможность работы с минимальным количеством материала;
• относительно быстрое получение результата (обычно от нескольких часов до суток).

Ограничения:

• ПЦР обнаруживает генетический материал, в том числе фрагменты нежизнеспособных (погибших) микроорганизмов, поэтому положительный результат не всегда означает активную инфекцию — возможны ложноположительные результаты после перенесённого заболевания;
• высокая чувствительность повышает риск контаминации (попадания посторонней ДНК в образец), что требует строгого соблюдения правил работы в лаборатории;
• необходимость специального оборудования (термоциклер, системы детекции) и обученного персонала;
• стоимость исследования выше, чем у некоторых альтернативных методов (например, экспресс-тестов).

¶ПЦР и другие методы лабораторной диагностики

ПЦР-диагностика дополняет, но не заменяет полностью другие методы. ИФА (иммуноферментный анализ) выявляет антитела к возбудителю и отражает иммунный ответ организма, что важно для определения стадии заболевания и формирования постинфекционного иммунитета. Бактериологический посев позволяет оценить жизнеспособность микроорганизма и его чувствительность к антибиотикам. Комплексное применение методов повышает диагностическую точность.

¶История применения в России

В России ПЦР-диагностика получила широкое распространение в 1990-х — 2000-х годах. Метод включён в федеральные клинические рекомендации по диагностике ряда инфекционных заболеваний. В период пандемии COVID-19 (с 2020 года) ПЦР-тестирование стало основным подтверждающим методом диагностики инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2; в России были развёрнуты сети лабораторий, выполняющих ПЦР-анализ в масштабах, ранее не имевших аналогов в отечественной лабораторной практике.

Источники:

• Маллис К. Цепная реакция. История изобретения метода ПЦР / пер. с англ. — М.: БИНОМ, 2014.
• Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.
• Лабораторная диагностика инфекционных болезней: учебное пособие / под ред. В. И. Покровского. — М.: ГЭОТАР-Медиа.
• Практическое руководство по полимеразной цепной реакции / под ред. М. А. Дистлер, Е. В. Касаткиной. — М.: Издательство РУДН.